[讨论帖]腺病毒包装(AD-easy系统)

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标题:[讨论帖]腺病毒包装(AD-easy系统)

BUK[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问一下做过这方面实验的学长和老师,转染后第一轮是不是一定要等14天(还是有病变就能收?),第一轮第二轮第三轮细胞若有病变应该是什么样,(能不能发张图),我是将细胞十天后直接冻融(不是吸去培养基用PBS重悬后冻融,再离心取上清),离心(多少转?)取上清.第二轮和第三轮要等多久(时间固定吗)?
做这个实验关键是哪几步,请各位帮帮忙,急啊!
这实验成功的概率多大

我第一次做的两个一个是第二轮无病变,另一个是第二轮也有病变(接毒后3天),第三轮没有!

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我第一轮转染后7天收的，反复3次冻融后（不离心，直接用）再感染第二轮，大概48小时可以看到病变，此后再按比例扩大（1：10没问题）感染，扩增病毒的，完全没问题，每次都能看到明显病变。病变的图片（大概为30小时左右的图）：

附件

2012-5-19 15:50

76620756.jpg (59.58 KB)

S6044[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问一下你转然的DNA有多少，用的什么转染试剂

BUK[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用LIP2000转的，使用量就是说明书上的量。

pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转染腺病毒载体一般的量1UG就够了,转染试剂一般的都行,293的转染效率比较高
从转染到出毒就是所谓的第一轮5-10d,由于这时病毒的滴度不是很高,离心最后一点培养基(可能含有少量的病毒)不要丢弃,用它重悬细胞,冻融后取上清感染已经种好的细胞,细胞的量对应的病毒液体积自己摸索,在8-25H就可以观察病变

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发表于 2012-5-19 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我新近转染了一个，按L2000的说明操作，可是第二天细胞就死了好多，不知道是什么原因，应该不会这么快吧！
作为对照的两个（一个只加了L2000，一个什么也没加）细胞都没出现那种情况。

pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该不会呀，一般说来，第一轮看不到明显病变是正常的，细胞都死了的话，估计不会是腺病毒的原因，可能跟你转染有关，或者你的质粒提取时没处理好，残留一些有机物。

S6044[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我到目前为止作过三次,第一次第一轮10天细胞漂起变圆,第二轮3天病变,第三轮一个星期都无病变.
第二此作了三个,第一轮三天有细胞漂起变圆(第10天收),第二轮6天有病变,还没做到第三轮.
第三次才转染,但第二天就有很多细胞漂起死亡.,绿色是为了方便看,不是荧光,是后来加的)

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Ad系统还是比较好用的,注意几点:
1, 细胞密度,,50--70%细胞汇合率时转染;第一轮密切注意细胞生长密度.细胞太密很难出毒.
2,转染试剂与DNA的量,以LF2000为例,60mm平皿细胞,1--4ug DNA,LF2000量为4--6 ul.
只要注意上两点,基本上可以出毒.
楼上用LF转染,肯定会导致一部分细胞死亡,漂浮,特别若是在转染第二天会看到细胞漂浮现象,说明LF量用大了.
当然,影响因素因素还很多,细胞的生长状态,DNA的纯度,培养基的质量,等等.
也贴一张出毒的图片,仅供参考.

附件

2012-5-19 15:54

12070990.snap.jpg (61.7 KB)

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-5-19 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1我想问一下做过这方面实验的学长和老师,转染后第一轮是不是一定要等14天(还是有病变就能收?),

2第一轮第二轮第三轮细胞若有病变应该是什么样,(能不能发张图),我是将细胞十天后直接冻融(不是吸去培养基用PBS重悬后冻融,再离心取上清),离心(多少转?)

3取上清.第二轮和第三轮要等多久(时间固定吗)?
4做这个实验关键是哪几步,请各位帮帮忙,急啊!

5这实验成功的概率多大,
6我第一次做的两个一个是第二轮无病变,另一个是第二轮也有病变(接毒后3天),第三轮没有!

———————————————————————————————————————————

1出毒为止,时间没有固定.快的5天,慢的甚至1月.

2不赞赏第一轮尚未确定出毒即盲目扩毒,很浪费财力物力.

3第二三轮就很快了,2--5天.

4对于第一次做的关键点很多,新手建议用带GFP报告基因的包装,便于积累经验.

5算这个没什么实际价值.

6首先要保证第一轮出毒后面才有戏.

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