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标题:[求助]心肌细胞培养疑问？

any333[使用道具]
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发表于 2012-5-24 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]心肌细胞培养疑问？



我培养sd乳鼠心肌细胞，有用Brdu抑制成纤维细胞的。也有差速贴壁培养，镜下心肌细胞胞体颜色较深，培养一段时间会伸出一些类似触角的突起，有聚集的特性，会搏动。但培养瓶里还长了其他细胞，贴壁快，贴壁后可以变得很薄，很大，胞质颜色很浅，呈不规则多边形，比心肌细胞大多了，而且感觉好像会增殖。不知道这些是什么细胞，考虑是成纤维细胞，但好像不是这种形状。师姐说可能是退化的心肌细胞，我还是很不明白。希望这里的师兄姐给个意见。图片下次贴上，谢谢！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-5-24 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在相差纤维镜下，除了从细胞的搏动区分出心肌细胞核成纤维细胞外，还可以从细胞形态鉴别：
成纤维细胞不搏动，平坦、胞浆清亮、一般比心肌细胞大，胞核也较大，有多个核仁，（可达7-8个）；
而心肌细胞搏动，细胞致密，高度折光，细胞核小，常有1到2个核仁。主要是心肌细胞有形成不规则的星形，并伸出伪足。
从你描述来看可能是成纤维细胞，成纤维细胞的形态也有多种，单纯从细胞的形态判断是什么细胞还是有困难的，如果实验对心肌细胞的纯度要求很高可以做免疫细化鉴别所需心肌细胞的纯度。
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any333[使用道具]
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发表于 2012-5-24 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外我还想请教一个问题，如果想做心肌细胞的爬片，心肌细胞的密度是不是要比较小，因为心肌细胞有聚集的特点，聚集后对荧光标记的拍照影响很大，在贴壁的心肌细胞上面，经常有一些圆形的未贴壁但黏附在细胞上面，荧光标记后，这些圆形的细胞就会呈现高亮，对荧光标记的判断很不利，请问有什么方法可以解决吗，谢谢！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-5-24 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对，做心肌细胞的爬爬片接种时密度要小一些，10 4到10 5之间吧，可以先试试5×10 4这个密度。粘附在成簇细胞团上是有一些细胞或碎片，偶也不知有什么好的方法去除，可以试着使培养的时间缩短一些（比如说接种后36小时或处理后24小时观察看看），另玻璃片上不要长得太满，长到大约80%满就可以拿出。
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any333[使用道具]
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发表于 2012-5-24 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用细胞计数板进行计数时，如果是10-4密度，一个大方格是不是才1个细胞。另外你计数的是活细胞还是没染色直接计的数？
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-5-24 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 any333 于 2012-5-24 13:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用细胞计数板进行计数时，如果是10-4密度，一个大方格是不是才1个细胞。另外你计数的是活细胞还是没染色直接计的数？

对，如果一个大方格（16个小方格）的平均是1个细胞，那么每毫升的细胞密度就是1（一个大方格的平均细胞数）×稀释倍数×10 4,活细胞和死细胞都要计数，可以看成活率，但活细胞必须要达到你所需要的密度
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any333[使用道具]
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发表于 2012-5-24 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！
我是差速贴壁后，台盼蓝染色计数，接种密度心肌活细胞1×10^5左右（2倍稀释，每大格不着色的5个左右）。但心肌细胞好像每次贴壁量也不完全一样，感觉有的时候贴壁很好，有的时候就很少。尤其是圆的不贴壁的细胞数量巨多，表面覆盖了一层，换液能冲掉部分，但仍有很多贴在细胞表面。你们每次实验也这样么？怎样才能减少这种心肌细胞？
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-5-24 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是差速贴壁后，台盼蓝染色计数，接种密度心肌活细胞1×10^5左右（2倍稀释，每大格不着色的5个左右）。但心肌细胞好像每次贴壁量也不完全一样，感觉有的时候贴壁很好，有的时候就很少。尤其是圆的不贴壁的细胞数量巨多，表面覆盖了一层，换液能冲掉部分，但仍有很多贴在细胞表面。你们每次实验也这样么？怎样才能减少这种心肌细胞？

————————————————————————————————————————————————————————————————

对。即使在接种后48h，镜下观察还是有不贴壁的心肌细胞。换液必然会冲掉部分，所以计数只能是大概的反应一下你的接种量。不过我仍然会48h后换液，个人认为此时如果还不贴壁估计细胞的状态不太好，可能是消化过程中不可避免的会对一些细胞造成损伤，换掉那些状态不好的细胞也没关系吧，纯属个人瞎猜，。也会有细胞贴在已贴壁的细胞表面。至于怎样减少没太在意，不过有几次2小时差速贴壁后要弃去的成纤维细胞我也养了，发现状态挺好的，48h基本都贴壁了，当然其中还有好多的心肌细胞搏动还蛮好的。对比心肌细胞和成纤维细胞还是心肌细胞比较难伺候吧。
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发表于 2012-5-24 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用1小时两次差速贴壁纯化心肌细胞，发现消化下来的成纤维细胞还是很多的，贴壁快，第一次贴壁后，用倒的方法倒出未贴壁细胞发现很多心肌细胞没有随液体倒出来，而且数量很多，同时发现成纤维细胞贴壁，稍微展开，没倒出来的心肌细胞还是圆形的。所以我有用吸管轻轻吹打一下，效果还不错。第二次贴壁已经少了很多成纤维细胞了。下次做我准备把贴壁时间缩短到40分钟。请问可否？还有用差速贴壁纯化心肌细胞后还有没有必要加5溴脲苷抑制成纤维细胞？请给个意见，包括一些操作,谢谢！
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any333[使用道具]
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 小中大
看样子想养的特别标准还是挺难。

我看{Simpson, 1982 #2}他们差速贴壁才30分钟，并且8小时就第一次换液。这篇文献好像很经典。Simpson, P., A. McGrath, et al. (1982). "Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines." Circ Res 51: 787-801.上面方法我都试过，差速贴壁，Brdu都只是纯化心肌细胞。产量还是靠合适的消化。只不过他用的是旋转培养瓶进行的消化，唉，咱玩不起。
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