[求助]腺病毒转染神经元，转进去GFP的神经元全部死亡...

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标题:[求助]腺病毒转染神经元，转进去GFP的神经元全部死亡...

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发表于 2012-5-24 13:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教有经验的网友们，我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元，转染率在5％左右，但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡，（而转进GFP的杂质细胞－如胶质细胞状态良好），神经元表面好像桑葚状，感觉要碎掉了，有的漂起来，看不到有GFP标记的神经轴突。

请教如下问题：

1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢？

2.如何提高腺病毒的转染率？可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是腺病毒和神经元共同孵育1h(使用刚盖过细胞的最小体积培养基),然后补加培养基到正常培养体积。请问，在腺病毒滴度一定的条件下，怎样的转染操作能使转染率提高？转染后，是否应该换新液，将腺病毒除掉？

谢谢大家！

附：
GFP图和可见光图

附件

2012-5-24 13:35

56232304.jpg (6.99 KB)

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发表于 2012-5-24 13:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可见光

附件

2012-5-24 13:36

47057543.jpg (26.45 KB)

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发表于 2012-5-24 13:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般腺病毒载体和腺病毒毒液是完全不同的概念
腺病毒载体转染细胞后包装出来的是腺病毒毒液，然后用毒液去感染你的细胞．
请问你的病毒是带ＥＧＦ的空病毒载体吗，看了你的图片很正常，一般腺病毒的感染效率是百分百的，或者不感染，腺病毒感染不了神经细胞，淋巴细胞，（你的带荧光的细胞好象是胶质细胞，个人觉得）
腺病毒本来就对细胞有一定的毒性，如果感染后出现在一定的时间出现大片的死亡，说明你的病毒载体里带有制毒基因，还有这和你的病毒滴度，感染时间有很大关系
我用病毒感染过胶质细胞，带荧光的，图片很美

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发表于 2012-5-24 13:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的表达不够准确，我是利用你提到的“腺病毒毒液”感染神经元的，谢谢指正！
我的病毒是带hrGFP的，和EGFP类似。我做的过表达载体，利用带hrGFP的空载体作为对照，奇怪的是，就连空载体（只表达hrGFP）的腺病毒感染的神经元都死掉了，这是为什么呢？
想请教一下，腺病毒可以感染神经细胞的吧，文献中有报道啊，针对我使用的的颗粒神经元进行腺病毒感染的文献在pubmed上也可以查到。你的意思是说腺病毒对神经细胞感染效率低吗？

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发表于 2012-5-24 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你的荧光不是很强，只能说明你的病毒滴度不是很高
请问你感染细胞的滴度是多少，时间很重要，如果是滴度很高，可以在２４Ｈ内可表达，细胞可出现死亡
腺病毒对细胞的感染效率不可能低，只能是可不可以感染的问题

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发表于 2012-5-24 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢回复！
实际上，我还没有测定滴度，想先看看收取的腺病毒到底能不能感染自己培养的神经元，以及大致估计一下现在的滴度有多高。我是把从一个10cm皿收集到的病毒（最初293贴壁率90-95％，收病毒时，细胞基本都变圆，>70%细胞漂起来－是不是有点收晚了？细胞经过4次冻融后离心，病毒收集到0.5ml PBS中）平均分散到6孔板的7－8个孔中感染，得到的感染效率大概在1-5％之间。

1.我现在最糊涂的问题是搞不明白，为什么感染对照组腺病毒的神经元（只表达hrGFP）也会死掉？

2.如何提高感染效率？请问，10个10cm大皿收集到的病毒溶解在1ml PBS中，得到的病毒滴度大概有多少pfu/ml？
如果想得到>50%的感染效率，收集到的腺病毒一定要经过CsCl密度梯度离心进行纯化吗（担心损失病毒，也担心染菌）？

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发表于 2012-5-24 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很可能是你的病毒毒粒很少.在你扩增病毒时,你用原始的病毒感染293时,看到的荧光多吗,亮吗,如果你本身的病毒毒粒少,感染时细胞的活性不好,最后得到的病毒滴度也不会有所提高的.在收集病毒是,变圆和飘落是个很典型的状态,病毒在体外的时间不要太上,只要你的293细胞不破裂,收毒的时间就不晚
1.一般空载体的病毒感染其他的细胞也会引起一定的死亡
2.首先腺病毒可以感染你的细胞,要提高转染效率,就提高病毒的滴度,你扩增病毒用的293细胞不够,建议用2个250ML的瓶扩增病毒收集时用1ML重悬,可得到1X1O 8-9pfu/ml,不用纯化。

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发表于 2012-5-24 13:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在的病毒滴度自己觉得应该比较高了。为了验证空载体病毒是否有毒，我使用对外界刺激抵抗力比较高（和我的神经元相比）的Hela细胞做空病毒载体感染，使用50ul感染一个24孔板中的Hela细胞，48h荧光显微镜下观察GFP，感染率接近100％。
使用的是空载体的病毒，现象是感染之后，此空Hela细胞就不再增殖了。不过看到以下现象：Hela细胞形状有变化，长出“触角”，而且呈现聚团状，各个聚团之间好像通过"类似于神经突触样的”连接形成蜘蛛网样的形状－而同时培养，没有感染的孔中，Hela细胞已经铺满整个孔了。形态发生变化的Hela图片见附件（注意，视野取的是24孔边缘，聚焦有点模糊，但是形态还是能看清楚）。

空载体病毒感染后,Hela细胞形态发生显著变化，这种现象在你的实验中有没有出现？我在想，这种变化是不是也是导致被感染的原代神经元死亡的重要原因？

附件

2012-5-24 13:38

21403548.snap.jpg (105.34 KB)

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发表于 2012-5-24 13:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再附一张40倍物镜照片

附件

2012-5-24 13:38

81288552.snap.jpg (84.24 KB)

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发表于 2012-5-24 13:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你感染ＨＥＬＡ细胞的图片很正常，要指出的是ＨＥＬＡ细胞感染病毒后形态是没有发生变化，由于你感染病毒后细胞无法正常繁殖，细胞也出现死亡后会聚集在一起，就是你的图中圆形的细胞，病毒把细胞撑得很满．很纤细的那些“触角”是因为得不到营养造成的，（正常的ＨＥＬＡ细胞本是有很大的“触角”，）
你的病毒滴度不高，在一个２４孔板加５ＵＩ就可以出现你图中的病变．
如果是这样，你的神经细胞也出现象ＨＥＬＡ　细胞的病变就是再正常不过了

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