[求助]初涉凋亡机制，请教各位怎么规划实验路线？

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标题:[求助]初涉凋亡机制，请教各位怎么规划实验路线？

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

已经得到了植物天然活性物的抑制肿瘤细胞的IC50，以及浓度时间曲线，

读文献发现后续的实验花样很多，比如流式的PI单染，AV-PI双染，乳酸脱氢酶检测，线粒体膜电位检测，细胞色素c释放，CASPASE-3激活，BCL-2表达等等，

我想探讨该药物促肿瘤细胞凋亡机制，该如何选取实验路线？这么多实验它们间那些是重叠的？那些又是有前后逻辑联系的？

望细胞版各位高手不吝赐教！

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

花样是很多；
1）PI单染基本无意义，只要死细胞全染上，要想证明凋亡，AV-PI双染比较好了，应该就可以了。同时可以用CASPASE3染色。

2）进一步了解是内源性通路还是外源性通路导致凋亡：乳酸脱氢酶检测，线粒体膜电位检测，细胞色素c释放, caspase9，Bax一般来说是内源性通路凋亡的标志；caspase8是常有的外源性凋亡通路检测标志。估计你那个是内源性通路导致的可能比较大，也可能两个通路都有一定作用。

3）BCL-2家族有一系列基因，有的处凋亡，有点抗凋亡，主要是通过对下面的BAX发挥作用来实现的，因此可以检测这些基因的变化。然后通过超表达或者RNAi验证这些基因表达的变化是否能对抗你的药物诱导的凋亡，从而了解药物的作用机理。

4）BCL-2上游的一些信号通路，主要是看看药物对AKT,ERK,SCR，STAT等通路活化的影响，确定是通过哪些通路影响BCL-2家族变化的。

我想这一套你能做完了，发个cancer research应该没什么问题了。

idea2011[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我同意园丁##的看法，认为：
1、用Annexin V&PI试剂盒初步检测凋亡
Annexin V&PI试剂盒的原理：
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
Loss of plasma membrane asymmetry is one of the earliest features，preceding
nuclear condensation, cell shrinkage, DNA fragmentation and loss of membrane
integrity. In apoptotic cells, the membrane phospholipid phosphatidylserine (PS) is
translocated from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane, thereby
exposing PS to the external cellular environment. While，late apoptotic，necrosis
and already dead cells lose membrane integrity，not only membrane asymmetry。
因此，实验开始阶段，可以药物浓度设一梯度、以诱导时间为另一梯度，用Annexin V&PI试剂盒检测以确定，最佳的药物浓度和诱导时间以及肿瘤细胞的凋亡和死亡率。优点：Annexin V&PI试剂盒操作简单、方便；检测灵敏度高；可同时检测早期凋亡和晚期的、死亡的。
2、探讨凋亡机制
可用Casepase测定法、线粒体介导的细胞凋亡检测法和其他凋亡相关蛋白检测来进行凋亡机制的研究。

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，您二位的详尽讲解让我明白许多，非常感谢！

另：在做药物浓度—诱导时间梯度实验时，可否用MTT法代替AV/PI？因为双染结果虽好，但每个样品都是计件收费，比MTT贵不少。

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在摸索药物浓度时可以用MTT，但是如果想了解凋亡还是最好挑几个不同浓度用Annexin-V和PI标记。因为MTT事实上反映的是活细胞数量，而和对照相比，实验活性细胞数量下降可以是凋亡导致的，也可以是细胞增殖受抑制导致的，因此MTT的变化并不一定和凋亡的数据相吻合。

我觉得如果考虑经费问题的话，先用MTT把药物抑制肿瘤细胞的条件确定好，然后挑3～4个浓度检测凋亡，看看诱导凋亡的浓度依赖性关系。

idea2011[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MTT主要用测细胞增殖的，即反映细胞数目的增减，和凋亡检测是不同的概念。

KGZ564[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

贴壁细胞做流式，怎么处理细胞比较好
不是说消化什么对细胞形象很大吗

一叶[使用道具]
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发表于 2012-5-24 16:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

该课题比较有意思。
做casepase的话，建议进行活性检测，采用荧光试剂盒。用荧光分光检测，我们这里做过很多，稳定性太好了。可以这么说，我们做了很多方法。包括Tunel染色、Bax/BCL的western. casepase活性片段含量测定。我就感觉Tunel染色和casepase活性最能让我信服，其他的实验总是感觉没底。例如western，有时候有，有时候没有，可是Tunel染色和casepase活性我们几乎能达到90%，而且数据非常稳定。如果有什么困难，可以找我讨论。
这就是我们发表的文章摘要。
Brain Res. 2008 Feb 27;1196:151-6. Epub 2007 Dec 28. Links
Mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning in neonatal hypoxia-ischemia rat model.Li Z, Liu W, Kang Z, Lv S, Han C, Yun L, Sun X, Zhang JH.
Department of Pathology, Weifang Medical College, Shandong, 261042, PR China.

Hypoxic ischemic (HI) injury in neonates damages brain tissues. We examined the mechanism of hyperbaric oxygen preconditioning (HBO-PC) in neonatal HI rat model. Seven-day-old rat pups were subjected to left common carotid artery ligation and hypoxia (8% oxygen at 37 degrees C) for 90 min. HBO (100% O(2), 2.5 atmospheres absolute for 2.5 h) were administered by placing pups in a chamber 24 h before HI insult. Brain injury was assessed by the survival rate, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), Nissl, TUNEL straining and caspase-3,caspase-9 activities after HI. In HBO preconditioned animals, survival rate was increased, infarct ratio was decreased, and the positive stained TUNEL cells were reduced, accompanied by the suppression of caspase-3 and -9 activities. These results indicate that a single HBO-PC appears to provide brain protection against HI insult via inhibition of neuronal apoptosis pathways

园丁##[使用道具]
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小中大

呵呵，才做这么点东西就想发Cancer Res？秀逗了吧。这些东西都是被做烂了的，除非你的药物是全新的，而且还要有in vivo的结果。否则这么小儿科的东西，最多发发中国药理学报或者anticancer drugs~

药物诱导的凋亡现在是作为药效的解释理由，完全是当成工具来用的，谈不上什么机制上的进一步创新。就算你把上下这一套都做完了，离发Cancer Res的标准还有很远的距离呢。

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Cancer Research 67, 209-217, January 1, 2007. doi: 10.1158/0008-5472.

An Organometallic Protein Kinase Inhibitor Pharmacologically Activates p53 and Induces Apoptosis in Human Melanoma Cells

1) PI单染基本无意义，只要死细胞全染上，要想证明凋亡，AV-PI双染比较好了，应该就可以了。同时可以用CASPASE3染色

The novel organometallic kinase inhibitors block the growth of melanoma cells in both two-dimensional and three-dimensional culture models

2) 进一步了解是内源性通路还是外源性通路导致凋亡：乳酸脱氢酶检测，线粒体膜电位检测，细胞色素c释放, caspase9，Bax一般来说是内源性通路凋亡的标志；caspase8是常有的外源性凋亡通路检测标志。估计你那个是内源性通路导致的可能比较大，也可能两个通路都有一定作用。

Treatment with DW1/2 induces apoptosis through the intrinsic mitochondrial pathway.

3) BCL-2家族有一系列基因，有的处凋亡，有点抗凋亡，主要是通过对下面的BAX发挥作用来实现的，因此可以检测这些基因的变化。然后通过超表达或者RNAi验证这些基因表达的变化是否能对抗你的药物诱导的凋亡，从而了解药物的作用机理

GSK3ß as a potential pharmacologic target of DW1/2-induced apoptosis.

DW1/2 up-regulates nuclear p53 expression and induces apoptosis in melanoma cells with p53-WT.

4）BCL-2上游的一些信号通路，主要是看看药物对AKT,ERK,SCR，STAT等通路活化的影响，确定是通过哪些通路影响BCL-2家族变化的。

Pharmacologic activation of p53, but not p53 overexpression, induces apoptosis in p53-WT melanoma cells.

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小中大

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Cancer Research 67, 756-764, January 15, 2007. doi: 10.1158/0008-5472.

Sphingosine-Induced Apoptosis in Rhabdomyosarcoma Cell Lines Is Dependent on Pre-Mitochondrial Bax Activation and Post-Mitochondrial Caspases

1) PI单染基本无意义，只要死细胞全染上，要想证明凋亡，AV-PI双染比较好了，应该就可以了。同时可以用CASPASE3染色

Exogenous exposure of rhabdomyosarcoma cell lines to the sphingolipid sphingosine induced apoptosis in a dose-dependent manner independent of rhabdomyosarcoma subtype

2) 进一步了解是内源性通路还是外源性通路导致凋亡：乳酸脱氢酶检测，线粒体膜电位检测，细胞色素c释放, caspase9，Bax一般来说是内源性通路凋亡的标志；caspase8是常有的外源性凋亡通路检测标志。估计你那个是内源性通路导致的可能比较大，也可能两个通路都有一定作用。

The mitochondrion acts as a central executioner in response to apoptotic stimuli, allowing signals from various inputs to converge

3) BCL-2家族有一系列基因，有的处凋亡，有点抗凋亡，主要是通过对下面的BAX发挥作用来实现的，因此可以检测这些基因的变化。然后通过超表达或者RNAi验证这些基因表达的变化是否能对抗你的药物诱导的凋亡，从而了解药物的作用机理

Cytochrome c release was associated with elevated levels of Bax within the mitochondrial fraction of RD cells treated with sphingosine

Down-regulated expression of Bax in RD cells using siRNA specific to Bax resulted in the inhibition of sphingosine-mediated apoptosis.

4）BCL-2上游的一些信号通路，主要是看看药物对AKT,ERK,SCR，STAT等通路活化的影响，确定是通过哪些通路影响BCL-2家族变化的。

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首先强行证明一下，还是可以发cancer research的，不过也认同您的看法，cancer research更偏基础，但是我认为应该是到了clinical cancer research的水准，anticancer drugs我不能下载，没看过。

就我个人观点而言，大多数药物研究本身就不是以揭示新机理为目标，而是阐明一个药物的作用方式。前面谈的这些确实不是什么高深的内容，而是凋亡研究中的套路，但是这部分研究已经可以讲完一个故事了

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