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标题:[求助]shRNA质粒转染

daod[使用道具]
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发表于 2012-5-28 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]shRNA质粒转染



大家好，我在RNAi实验中碰到了很大的困扰，请高手帮帮忙吧

我的实验主要是通过脂质体（Lipofectamine 2000）将shRNA质粒转进胃癌细胞，从而实现目的基因敲除；有乱序shRNA质粒做对照，转染效率是通过质粒上的GFP的表达来判定的。质粒提取试剂盒是天根的大抽试剂盒。

实验安排是这样的：未处理组，只加脂质体组，只加质粒组，乱序质粒组，处理组。

转染24h后，光学显微镜下可以明显看到乱序质粒组和处理组细胞死了一大片，而其它组的细胞生长都很好。
流式细胞仪检测GFP表达情况时却发现乱序组和处理组的转染效率不一样，乱序组可以达到83％，而处理组只有42％。

理论上乱序组的细胞是不会死亡的。shRNA的载体是从国外拿过来的，国外的实验室他们用乱序质粒时没有出现细胞死亡的现象。

我的实验问题到底出在哪里呢？大家帮帮忙吧。


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daod[使用道具]
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发表于 2012-5-28 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是乱序处理组


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发表于 2012-5-28 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是处理组


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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-5-28 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的实验目的是什么了,我从你的实验给我的意思是要通过转染细胞后测转染效率来判断你的SHRNA是不是有效
1.你的乱序组是设为阴性对照吗,质粒是带有绿色荧光的,但前提是这个质粒是不含有其他的任何基因的,在细胞里只会表达荧光的
2.处理组的荧光效率比乱序组的少很多,是很有可能的,说明你的SHRNA含有的基因会干扰你的荧光表达,
3.用LIP2000转染细胞,因为LIP2000对细胞的毒性很大,细胞出现死亡是很正常的.
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daod[使用道具]
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发表于 2012-5-28 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实验的目的是为了敲除目的基因啊，研究该基因的相关功能。

乱序组是做为对照用的，质粒上带有GFP，氨苄抗性基因，没有其它基因。乱序组的序列Blast过，没有问题。

LP2000对细胞是有毒性，但我做了对照（只加LP2000），对细胞的影响不是很大。

反倒是空质粒组，理论上应该不会造成细胞大量死亡的。转染48后，细胞所剩无几了。

有可能是内毒素的问题么？我提质粒用的是天根公司的大抽试剂盒。

大家帮忙分析一下吧。我快要崩溃了！
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-5-28 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有可能是内毒素的原因，你的质粒本来就带有毒性但是天根不是有提大提用的去除内毒素的试剂盒吗
现在有一种培养基是专门用来转染用的，是可以减少内毒素，一些酶切留下来的蛋白的什么的
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 小中大

我用的就是天根的去除内毒素试剂盒啊。并且只加质粒的话细胞不会死的，因此可以认为没有内毒素的。

你说的是OPTI－MEM么？效果真的那么好么？
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发表于 2012-5-28 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建議用Fugene-6試試。
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 小中大

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