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标题:[求助]细胞稳定转染建系后，再转染另一种质粒效率急剧下降

kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞稳定转染建系后，再转染另一种质粒效率急剧下降



细胞稳定转染建系后，转染的质粒细胞内本身有较高表达，我的质粒是点突变的质粒，我做的是稳定转染，按理论稳定建系后不应该对细胞增值有影响的 。
根据实验设计，我往已经稳定建系的细胞中，再瞬时转染了带报告基因的另一种质粒，同时往野生型即没有转染任何质粒的细胞中也同时转入了相应报告基因质粒，两者相比稳定转染的细胞系转染效率与野生型相比明显低了几百倍。报告基因的读值一个为20几万，而稳定建系的只有几万，相差太大了。重新复苏细胞结果还是如此，各位高手谁能帮我分析一下，我将万分感谢。
马上要毕业了，这个结果差异这么大，真不知道该怎么解释了。谢谢大家。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个没经验现在也在建 cell line，以后也要在cell line 中转染另一种质粒，所以只好友情帮顶了

不过还是想问下lz是用什么方式转染的啊？？我们实验室用lip2000转染，还有电转仪转染，lz可以试试不同的转染方式看结果怎么样啊
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

共同学习。我的理解是要看两种质粒的复制体系是否为同一套或者相似，如果这样就会竞争抑制，也就是只有一个馒头我吃了，你就没得吃。如果这样现在有报告基因的质粒选择很多，换一种应该可以。赫赫，愚见。
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的，复制体系不同的，还是搞不明白
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铜雀[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
共同学习。我的理解是要看两种质粒的复制体系是否为同一套或者相似，如果这样就会竞争抑制，也就是只有一个馒头我吃了，你就没得吃。如果这样现在有报告基因的质粒选择很多，换一种应该可以。赫赫，愚见。

————————————————————————————————————————————————————————————————

质粒的复制体系竞争是指的原核复制过程中具有相同复制起始位点和利用同一复制体系的质粒互相竞争，即分子克隆上讲过的质粒不相容原理。但是质粒在真核细胞内没有复制过程，也就没有这一现象。所以应该不是这个原因。

我理解也是一种竞争性抑制，但是是和质粒的表达有关。由于真核质粒多采用CMV等强启动子，所以表达水平很高，对胞内的转录资源是一种显著占用。这也就是高水平表达的稳转细胞株反而不易存活的原因－－外源蛋白过度表达占用了正常功能蛋白表达的资源。
因此，稳转后再转染另一质粒，应该很难获得和初次转染一样的高表达效率。

同时，相同真核启动子之间是否也有直接竞争关系？这个也有可能的。我们看到成熟的商品化载体在同时表达两种蛋白产物时（如EGFP和neo），均有意采用不同启动子和不同的转录终止区。从pEGFP-N1的载体图可以看出。这说明这种竞争很可能是存在的而且应该避免。楼主先后转染的质粒可能也是同一启动子启动目的基因的，可以尝试第二种质粒换一个启动子试试，例如TK（胸苷激酶）启动子启动的pGL3-promotor


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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个不要紧的，我也做过两个先后转，后面一个转染效率大概在2%，但我还是用流式细胞仪分选筛出了稳定转染两个基因的细胞。不过如果你的实验只能做瞬转就没办法了
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的。
我稳定转染的质粒是PCDNA3.1，应该是CMV启动子。
瞬时转染的质粒是从PGL-3改建的，好像用的也是CMV启动子。
应该是这个原因吧，谢谢。答辩的时候不知道能否这样解释呢？
希望继续探讨，谢谢。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从新构建不同启动子的质粒，再进行共同转染。要么先进行稳定转染的质粒是PCDNA3.1进行转染，筛选到稳定的细胞株，再进行瞬时转染的质粒转染。
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是先稳定转染了一个质粒后又瞬时转的
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你答辩时间就这么紧么？找个pGL3-promotor应该没这么难吧？转染一下看看就很清楚了。

实在不行，你密我下地址，方便的话寄给你一点
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