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标题:[求助]细胞形态突然发生了变化，而且好多脱壁了...

tie8[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞形态突然发生了变化，而且好多脱壁了...



我养的HT1080细胞，刚从atcc买来，开始状态很好，细胞消化脱壁后是很好的圆形，而且都会贴壁生长，后面传了4到5代的时候，发现细胞消化后，不再是很光滑的圆形，而是表面比较粗糙，仔细看好像是细胞膜表面伸出了好多非常小的圆形小泡围绕在细胞周围。培养过程中有很多细胞脱壁，有的呈团簇状，不知道是怎么回事，请高手帮忙分析一下。我用的是0.025%trypsin-0.75mM EDTA作消化液，消化不超多5分钟，吹打后发现有部分细胞仍然贴在培养瓶上，但是担心消化过长不好，就没有进一步消化，然后就把传代悬液倒回瓶中，不知道这个操作是不是有影响，还是什么别的原因，请大家帮忙，我这细胞刚买来，要是养死了就麻烦了。
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发表于 2012-5-28 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你消化时在镜下观察，不用担心消化过了，看着细胞间质分开大部分就可以停止消化，把消化液用胶头滴管吸去弃掉的，用手敲一敲瓶壁，能慢慢下来就好了，加5毫升培养液吹打分散即可。你可以和我联系。
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发表于 2012-5-28 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家有问题互相交流就是了。这样可以学到不少东西的。我的同事也遇到过这样的问题。后来按我说的就解决了。不用慌张。注意胰酶量不要太大。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢你的热情帮助。对于25cm2的培养瓶，你一般用多少胰酶啊？还有，我由于怕把握不好消化时间，造成细胞丢失，就消化到差不多时，就往里面加培养基（对胰酶的比例差不多1：1~2:1）来终止消化，然后吹打后离心，我现在不确定培养基的量足不足以破坏胰酶的消化。
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发表于 2012-5-28 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的培养瓶大概能装80毫升培养液，培养细胞时加10毫升左右培养液，加多少胰酶根据细胞而定，我养的是3T3，一般先用PBS 洗一变，然后加1.5毫升的EDTA（0.02%）和0.5毫升的胰酶（0.25%），在镜下消化观察，你那样操作比较容易消化不够。需要自己摸索尝试。
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发表于 2012-5-28 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
忘了说了，我们消化完弃掉消化液，不离心直接加含少量（5毫升）10%小牛血清的DMEM，吹打分散细胞然后传代，怕长老了，就先分不同量传几瓶。一定要勤快，以为老师曾说过养细胞跟养孩子差不多，一定不能等老了在传。
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发表于 2012-5-28 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

严重同意楼上的说法，不离心直接加入完全培养基，等细胞贴壁之后及时用PBS清洗并且加入新鲜培养基，记住一定要及时清洗，以减少胰酶以及EDTA的影响
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用含EDTA的胰酶消化，如果不离心，细胞还能贴壁吗？？
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jkobn[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不离心不行，一定要用新鲜培养基清洗细胞一次，再接种，否则细胞很难贴壁贴壁生长。
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kulee[使用道具]
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发表于 2012-5-28 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们消化后，用胶头滴管吸取弃掉消化液的，细胞能贴壁，没问题的。
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