细胞世界

谢谢您的回答。想再了解得具体点！希望帮助。由于经费问题，所以不能购买Beckman的试剂盒。
1.用4％的多聚甲醛固定，一般用量多少，固定多长的时间？
2.我也想过用淋巴细胞的膜表面标志设门，这样的话，又要从新购买国外的试剂，这样得花很长得时间，可我时间不允许呀！万一真的要这样，不知是用CD3还是用CD4标记好呀？
3.关于透膜的问题，您说用甲醇，一般剂量用多少呀，通透多长的时间？不知能不能用tritonX-100,若能，一般的浓度和剂量多大，孵育多长的时间呀？
4.关于测细胞内的抗原，用全血做流式，是最先溶血，再加固定－－破膜剂－－抗体，还是最后一步溶血呀？
盼指导！

1)一般来说我们用的细胞会更多一点，大约5×10^5，悬浮在0.5ml的PBS中，然后加入多聚甲醛，至终浓度为4%，室温固定10分钟。

2）虽然我没用过大鼠，不过CD3应该是T淋巴细胞的标志物，而CD4则表达在辅助/调节T淋巴细胞上吧，，如果是检测reg T可以用CD4；但是你说要看淋巴细胞，那你B淋巴细胞怎么办,CD19是B细胞的标志物。仔细想了了想，如果你的完全不分群了，即便用了标志物也不是很好，因为CD4还表达在单核细胞上，我们使用CD4的时候还是借用了SSC，还是做固定吧。

3）固定完成后，把细胞悬浮在50微升的PBS中加入450微升的甲醇至终浓度为90%。TRITONX-100好像也是常用的方法，但我没有试过。

4）你还真把我难倒了，呵呵。试剂盒的顺序是固定——破膜和抗体（红白细胞一起破了），如果是用自己的试剂做，我分离的单个核细胞，没有溶血这一步。不过我们做白血病免疫分型时，是先标记膜表面抗体，溶血，破膜（没固定），然后标记胞内抗体，所以我想先溶血吧，呵呵。

哦，没做过大鼠啊，你直接问问公司吧。

您好。我最近做了好几次，可是做了好久，总是阴性的结果，希望得到帮助：
做的是大鼠淋巴细胞内的抗原检测，大概步骤如下：
1.取抗凝血50ul,用coulter专用溶血仪器溶血，并离心去上清；
2.用4%多聚甲醛100ul固定约15分钟，用2mlPBS清洗，离心去上清；
3.加0.1%tritonX-100约50ul破膜约15分钟;
4.加带荧光表记的抗体10ul,室温避光孵育30分钟，用PBS清洗
5.加适量PBS重悬，上机检测
结果：做了好多次，总是没有阳性的结果。检测时的细胞分群还算比较理想，能够分得出淋巴细胞群，但就是没有阳性结果。已经用荧光显微镜检测过抗体没有问题。不知道问题出在哪里，还请园子里得朋友帮忙。好急呀！
不知道是不是透膜的问题呀，如果是，该怎么改进呀？