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标题:[求助]HUVEC原代消化，胰酶打进去，抽不出来？

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发表于 2012-5-28 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]HUVEC原代消化，胰酶打进去，抽不出来？



诸位战友，我正在做HUVEC原代培养，一个月了，还没看见一个内皮细胞，快崩溃了，有个问题现在一直没解决，就是20cm左右的脐带，冲洗后，注入0.25%胰酶及0.02%EDTA混合液15~20毫升，37度水浴20分钟，可是消化结束后，眼看着液体抽不出来，最近三次一直这种情况，请诸位帮忙分析一下，这到底是为什么呀？
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发表于 2012-5-28 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室做HUVEC的原代培养消化时脐带两头插导管，用止血钳封闭导管，消化结束后两头的封闭小心打开消化液直接流出，不需要抽的。不清楚你是在怎么样的情况下用什么东西 抽的，另外我们消化的时间在12~15分钟左右，时间太长会有杂细胞，内皮的状态也不好。
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发表于 2012-5-28 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
眼看着液体抽不出来，

——————————————————

有“胶状物”产生，消化过了？
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发表于 2012-5-28 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢诸位的帮忙，我是用输液器的头插入一端，用丝线结扎，另一端在冲洗后用丝线结扎死。因为前段时间消化后有胶状物产生，也考虑是消化过了，所以，现在单用0.25%的胰酶，只消化5分钟，输液器端呈囊肿状，还是抽不出液体，只好剪开另一端，有时可以推出液体，有时只能用挤的。内皮很少。
有几个问题：
1、如果不结扎，是否需要处理脐动脉，如何保证向外冲消化液时不混入血细胞？
2、输入液体端，用什么好一点，输液器头端总是囊肿样，考虑可能是打液体时管壁受力太大，消化时提前脐带其他部分损伤内膜；如果用针头太尖锐；不知道上面的师兄提到的导管是哪种？
3、脐带打入胰酶后呈阶段性膨胀，有时候20cm的脐带，只打进去5ml的胰酶，就这样了，其他不膨胀的部分就像没有液体一样，消化不到10分钟，膨胀部分的液体就推不动了，是脐带本身的原因么？
出现的问题我会不断的发上来，大家一起帮忙，一起讨论呀。
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发表于 2012-5-28 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵我不是师兄~
我们实验室用的导管是到玻璃加工厂定做的，玻璃管一端用来插入到静脉里面，玻璃管上有一圈凹槽，方便绳子结扎，另一端连有硅胶管，用于止血钳封闭。两根管子分别插到脐静脉里以后用绳子结扎住，防止管子从静脉中滑落。
用注射器将0.25%的胰酶从一端注入脐静脉，等气泡都排出以后，止血钳封闭另一端导管，随着胰酶的注入血管慢慢膨胀，一直到注射器灌注胰酶感受到明显压力的时候停止灌注，同时将注射器段的硅胶管也用止血钳封闭，然后消化10~15分钟，再像我前面说的两头打开收集消化液，还会用培养基再冲洗两遍，然后离心再重悬浮就可以了。
你把一端结扎死了当然没办法把液体抽出来的，两端都打开液体很容易就流出来了。脐带有的时候确实会有些部位血管很鼓有的地方却很瘪，这个没什么影响吧。一般我们20公分的脐带能打进去15ml作用的胰酶。多摸索几次一定可以做出来的。
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发表于 2012-5-28 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很感谢战友的帮助，我这没有条件定做特殊的导管，我把输液器针头端的小细塑料管套在注射器的针头上，插入脐静脉，用止血钳钳夹，效果还不错，呵呵，也许对有些战友是个帮助。
我用的胰酶是GIBCO的，感觉效果很强，消化10分钟，几乎每次都能看见胶冻样粘稠的东西，离心也离不下来，有时候观察到细胞核比红细胞还小的小梭形细胞，不知道是什么，我考虑胶冻样东西可能是内或外弹性膜，小梭形细胞也许是纤维细胞，不知道大家是不是也遇到过？
经战友提醒，也考虑是消化过了，现在缩短消化时间，没有胶冻样东西了，可见内皮细胞，只是细胞数很少，所以不长，不知道大家通常一根脐带消化下来的细胞是不是放在一个25平方厘米的培养瓶里，还是放在孔板里？
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 小中大

呵呵，导管如果需要短信交流，我们也是用GIBCO的胰酶0.25%消化，消化时间是要摸索的，我们实验室的经验是消化快要结束的时候把整个脐带顺着血管搓一搓，据说可以消化下多一些细胞，细胞离心重悬的时候，如果用枪很难吹散，那么接种后贴壁和生长情况都不会太好。至于接种到瓶子或者孔板要根据你自己的实验需要吧，我们因为培养时没有添加生长因子，细胞都不传代，所以都直接接到孔板或者小皿里面，要是有条件传代种到培养瓶也没有关系的。
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发表于 2012-5-28 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在做原代培养,原代还可以不过一传代就不行了,我也考虑在元代就用,不过怎么计数呢? 请问一下楼上的,你们的细胞做原代,是怎么计数呢?悬浮下来就计数吗?一段20CM的脐带能分几瓶?
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发表于 2012-5-28 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谁能发张脐静脉内皮细胞的图片?
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zhenxin[使用道具]
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 小中大

用血球计数板计数，我们一般接24孔板一板左右
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