生物实验技术

来自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所的研究人员发表了题为“A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins”的文章，应用氧化还原敏感的Gaussia荧光素酶和绿色荧光蛋白GFP，报告融合蛋白所处的不同氧化还原环境，从而鉴定目标蛋白质在细胞内的亚定位及其拓扑结构。相关成果公布在PLoS ONE杂志上。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')
领导这一研究的是上海生科院生物化学与细胞生物学研究所胡红雨研究员，其研究组主要研究方向是蛋白质错误折叠、淀粉样积聚和降解作用的分子机制及与神经退行性疾病的关系。第一作者是博士生李海音，这项研究得到了国家科技部、中国科学院和国家基金委的经费支持。
真核细胞中约有三分之一的蛋白质进入内质网进行折叠、修饰、膜整合、转运和分泌，内质网内和跨膜蛋白在这些过程中发挥着重要的功能。但是，由于跨膜蛋白疏水区域与膜脂结合的复杂性，以及内质网蛋白质的动态性，现有的鉴定内质网蛋白的定位和跨膜拓扑结构的方法非常有限，且存在操作技术繁琐等问题。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')

Gaussia荧光素酶（Gluc）是近年报道的分子量最小、活性很高的荧光素酶，含有五对二硫键，需要在内质网的氧化环境中才具有完全的发光活性。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')
在这篇文章中，研究人员利用Gluc的发光活性对氧化还原敏感的特性，将Gluc与GFP串联表达作为新的报告基因，融合于内质网跨膜蛋白的不同位点，并在HEK 293T细胞中表达。他们以Gluc的发光活性检测融合位点的氧化还原环境，而用GFP的荧光强度检测融合蛋白的表达量，从而报告不同融合位点的相对氧化还原环境。
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该方法可用于区分其定位于内质网或者细胞质，以此鉴定内质网蛋白的定位和拓扑结构，已成功应用于单次跨膜蛋白（如calnexin、Sec61g 和CD3δ）和多次跨膜蛋白（如Herp和HRD1）的拓扑结构。该方法灵敏度高、简单快速，使内质网蛋白拓扑结构的高通量鉴定成为可能。
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也可进一步应用于鉴定细胞膜蛋白的拓扑结构，以及检测蛋白质分泌途径中的氧化还原环境变化，将为研究蛋白质在内质网中的定位、折叠、氧化还原和修饰，以及动态的膜整合、转运和分泌提供更加适用、方便和高效的生化和细胞分析技术。