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标题:[求助]流式与werstern的区别

eric930[使用道具]
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[求助]流式与werstern的区别



请问哪位大侠知道在测量细胞蛋白含量方面流式与western 有什么区别。
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qqq111[使用道具]
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我也很想知道,如果可以用流式检测细胞的蛋白表达,试验将变得轻松和多。
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yysr238[使用道具]
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知道一些,不足之处请大家补充:
1、Western 是检测蛋白表达的金标准,可用于检测细胞多种类型的蛋白;流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白,虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白,但对于分泌蛋白却是无能为力的;
2、Western测蛋白含量对抗体的量需要很少,一般1:1000左右,而流式对抗体的需要量很大,一般1:50(很浪费抗体);
3、采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参,而流式一般要把每个样品分为两份,同时都做只加二抗(FITC标记的)的对照,这样平均到每个细胞的发光就不用内参了;
4、就个人经验而言,流式用多抗不好,单抗标出来不错,具体原因不太清楚。

多多交流!
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junhun[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 yysr238 于 2012-5-29 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
知道一些,不足之处请大家补充:
1、Western 是检测蛋白表达的金标准,可用于检测细胞多种类型的蛋白;流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白,虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白,但对于分泌蛋白却是无能 ...

呵呵,我个观点完全不同啊。
1)在有合适的抗体的情况下,流式在检测膜表面蛋白时显然比较方便,比WESTER要方便很多;对于胞内蛋白是比较麻烦,现在有胞内标记的试剂盒出售,但是个人感觉,非特异性比较强,比较难于控制;说流式完全不能测分泌蛋白是个误会,实际的情况是,目前流式在测分泌性蛋白的试剂盒不多,但其实前景很大。从流式原理来看,它需要被检测目标是有一定大小的颗粒(比如细胞),但是蛋白的尺寸太少,直接检测不到,所以现在用的是所谓磁珠辅助系统,具体原理我没注意过,估计也就是把抗体标记在小磁珠上,然后和标本混合,样品中蛋白浓度越高,磁珠上吸附的也越多,然后再加一个标记荧光的抗体,然后检测磁珠的荧光强度反映目标蛋白的浓度,BD老早就有些细胞因子的试剂盒了,而且现在所谓液态蛋白芯片就是从这个发展来的,专门用流式的技术检测可溶性分子。

2)抗体的用量,其实一般厂家推荐的都大大过量了,减半一般是不会有问题的的,甚至用1/5可能都可以,但是要试。不过我想问的问题是,在大多数情况下,大家不觉得WB的抗体一般都只用了一小部分,多的也是浪费了么?

3)内参,事实上不是流式不能做内参,而是流式没必要做内参。可以仔细考虑WB为什么要内参,是因为不确定用的细胞量是否一样多(起始量是一样多,但是操作过程中的误差不可控),所以在基于内参不受药物或者别的处理影响的假设上,内参是保证用了同样多的蛋白。而流式它检测的是同样多的细胞,测量的是每个细胞上蛋白的表达强度,根本不需要内参的存在来做均一化,要得是一个阴性对照,设定本底荧光。是否把标本等分根本无关紧要,分得一样多也是白分了,因为不会把所有的样品上完。

4)流式的抗体和WB的抗体是不同的(有部分可以通用),多抗一般是大的变性蛋白为抗原制备的,而WB的中被检测蛋白就是变性状态,所以很吻合,而流失中一般蛋白还是保持了天然构象,所以产生的多抗可能不太好,而需要用很小特定的决定簇为抗原制备单克隆抗体。
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yysr238[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 junhun 于 2012-5-29 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


呵呵,我个观点完全不同啊。
1)在有合适的抗体的情况下,流式在检测膜表面蛋白时显然比较方便,比WESTER要方便很多;对于胞内蛋白是比较麻烦,现在有胞内标记的试剂盒出售,但是个人感觉,非特异性比较强,比较难于控制;说流式完全不 ...


多谢楼上战友的批评指正!
1、对于第一个问题,并不是说流式完全不能测分泌蛋白,而是根据其检测原理必须引入辅助颗粒来实现。正如您所说的,所谓磁珠辅助系统,但是对特定抗体标记的辅助颗粒大规模商品化之前,可能还是western和ELISA更容易实现;
2、抗体的用量比western大很多这是不可回避的问题。另外,在做western时我们有回收一抗继续使用的情况,流式可以吗?!
3、对于内参和阴性对照的问题,内参不多说了。阴性对照的作用是排除本底荧光,难道不是用只加荧光标记的二抗来排除吗?其实就是非特异性吸附,那么如果不把细胞均匀的分为两份的话,细胞数多的话是不是非特异性吸附也多?!
4、第四点非常感谢战友的热心解答!

多多交流!
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junhun[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 yysr238 于 2012-5-29 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


多谢楼上战友的批评指正!
1、对于第一个问题,并不是说流式完全不能测分泌蛋白,而是根据其检测原理必须引入辅助颗粒来实现。正如您所说的,所谓磁珠辅助系统,但是对特定抗体标记的辅助颗粒大规模商品化之前,可能还是wester ...

呵呵,我不是流式的试剂商,没有打算推销流式抗体的的打算,所以也不是要大家不做WB。我前面也说了,在胞内,可溶性蛋白方面,流式目前还有局限,而且流式抗体比较昂贵(直标抗体),但是应该来说发展前景还是很可观的。

确实是WB比较节约抗体,但是除了对大型实验室,多个人做同一个特定的项目,多数抗体都是用不完的,所以放着也是浪费了,因此在有选择的情况下,我倾向于流式,毕竟简单多了。

理论上是在多少细胞中加多少抗体,但实际上细胞均分的问题是没有必要的,因为抗体一般都是过饱和的,所以在细胞没有数量级的差别的情况下,并不会看到明显差别。如果说实验组细胞实在太多导致抗体不足的话多的话,容易产生的问题是背景荧光偏低,造成假阴性,而不是造成非特异性吸附。

另外抱怨一下,这么不给我加分啊,这可是我第一次在细胞技术栏目发帖啊,跟郁闷的是,在我的论坛中这个帖子居然还不在我的名下。
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关键区别:
WB做的是整个细胞群体中某种蛋白(或其他分子)表达水平的平均值,而流式可以测每个细胞内某种蛋白的表达变化,因此流式更敏感.

另外流式一个样品可以同时做双/3/甚至更多色荧光标记,观察指标更多.
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fklo83[使用道具]
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关键区别:
WB做的是整个细胞群体中某种蛋白(或其他分子)表达水平的平均值,而流式可以测每个细胞内某种蛋白的表达变化,因此流式更敏感.

另外流式一个样品可以同时做双/3/甚至更多色荧光标记,观察指标更多.
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eric930[使用道具]
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学习了
谢谢大家

大家探讨的这么热烈
再结合ELISA 这个实验技术谈谈三者的区别吧

再次感谢!
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vera+[使用道具]
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western 对于可溶性的蛋白,血清中的蛋白是检测对象;只能是比较泛泛的检测,不能明确到某些细胞亚群,不能比较精确的进行定量。

流式的检测一般是针对细胞来说,可以单个细胞的检测,也就是说是在单个细胞水平来区别,更加精确。 主要是对膜上的蛋白,胞内的核内的通过穿孔效果也是很好。

两者互相补充,各有优势。
ELISA,也比较好,相对于westen 老说较简单,敏感。但是有的时候没有相应的抗体是比较头痛的事情/或者说抗体更贵
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