小中大[求助]我养的骨髓基质细胞怎么了!
最近一直在培养骨髓基质细胞,前段时间养得挺好的,可以传到8,9代都没问题,增殖也很快,一瓶长满90%的细胞传三瓶,三天就长满了。最近养细胞却一直出现了一个很奇怪的现象,就是细胞传代后,第一天和第二天都还长得好好的,状态都不错,增殖情况也可以,可是到了第三天,还没有长满的细胞就会变成树枝状,分叉很多的那种,也基本不增殖了,如果这个时候传代的话,细胞虽然恢复了以前的形态,但是就再也不增殖了。如果不传代,到了第四,五天,细胞就会无一幸免的出现老化一样的症状,细胞碎裂,崩解,最后就全部脱离瓶底,死亡。我试着又做了4,5次原代培养,开始几代都培养的还可以,可是到了3,4代以后,就会逐渐出现这种症状。如果细胞传代的密度稍微低一点(大概50%)就算是第2,3代,也同样会出现这种情况。郁闷死了,我把照片贴在下面了,我还把我培养的大概条件给大家说一下,请大家帮我看看究竟是哪里出现了问题:
培养情况:
1. 原代培养的是新生大鼠(出生9-10天),原代采用的培养基是a-MEM(Gibco),15%胎牛血清(Gibco),pH=7.0,采用的是全骨髓培养法,72小时后全量换液,换液后大约2-3天原代细胞基本长满了瓶底,然后传代,获得第一代细胞。这一部基本上没有出现过问题,细胞增殖的速度很快。
2. 传代培养的培养基是a-MEM(Gibco),10%胎牛血清(Hiclone),pH=7.0。传代的时候我感觉是密度不能太低,一般至少要达到60以上,否则细胞的增殖会受到影响。也不能让细胞长得太满了再传,感觉这样细胞就长老了。
3.0.25%胰蛋白酶37度消化2-3分钟
4.3-4天长满90%传代,第二天不换液(消化的时候胰酶去得比较干净,所以我一般不换液),直到传代,一直都不换液
我自己对照了以前的培养方法,步骤,培养基什么的都是一样的条件,猜想有可能的原因是:
1.pH值不合适,我现在的培养基pH是7.0。我以前用的是7.2,但是这个微小的差别会对细胞有这么大的影响吗?那么骨髓基质细胞培养的最适pH值究竟是多少呢?
2.细胞营养枯竭。但是我养过别的原代成纤维细胞,有的细胞6,7天不换液也就是不怎么增殖了,也不至于细胞发生这么大的形态变化,甚至最后死亡了。我也曾经试过在培养的第3天换液,但是细胞照样也会出现形态的改变,最终发展到死亡。
3.密度抑制。但是从图中你也能看到,这个密度最多只有70%-80%左右。我以前样的骨髓基质细胞,增殖到100%再传代也没有遇到过这样的问题。
恳请有过培养骨髓基质细胞经验的战友相助,我在这个问题上已经困扰一个多月了,试验一点进展也没有,都快对养原代细胞产生恐惧了!!!!帮帮我看看究竟是什么原因呀?
下面是培养骨髓基质细胞第三代的照片(形态,密度什么的都还算正常):