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标题:[求助]我养的骨髓基质细胞怎么了!

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[求助]我养的骨髓基质细胞怎么了!


最近一直在培养骨髓基质细胞,前段时间养得挺好的,可以传到8,9代都没问题,增殖也很快,一瓶长满90%的细胞传三瓶,三天就长满了。最近养细胞却一直出现了一个很奇怪的现象,就是细胞传代后,第一天和第二天都还长得好好的,状态都不错,增殖情况也可以,可是到了第三天,还没有长满的细胞就会变成树枝状,分叉很多的那种,也基本不增殖了,如果这个时候传代的话,细胞虽然恢复了以前的形态,但是就再也不增殖了。如果不传代,到了第四,五天,细胞就会无一幸免的出现老化一样的症状,细胞碎裂,崩解,最后就全部脱离瓶底,死亡。我试着又做了4,5次原代培养,开始几代都培养的还可以,可是到了3,4代以后,就会逐渐出现这种症状。如果细胞传代的密度稍微低一点(大概50%)就算是第2,3代,也同样会出现这种情况。郁闷死了,我把照片贴在下面了,我还把我培养的大概条件给大家说一下,请大家帮我看看究竟是哪里出现了问题:

培养情况:
1. 原代培养的是新生大鼠(出生9-10天),原代采用的培养基是a-MEM(Gibco),15%胎牛血清(Gibco),pH=7.0,采用的是全骨髓培养法,72小时后全量换液,换液后大约2-3天原代细胞基本长满了瓶底,然后传代,获得第一代细胞。这一部基本上没有出现过问题,细胞增殖的速度很快。
2. 传代培养的培养基是a-MEM(Gibco),10%胎牛血清(Hiclone),pH=7.0。传代的时候我感觉是密度不能太低,一般至少要达到60以上,否则细胞的增殖会受到影响。也不能让细胞长得太满了再传,感觉这样细胞就长老了。
3.0.25%胰蛋白酶37度消化2-3分钟
4.3-4天长满90%传代,第二天不换液(消化的时候胰酶去得比较干净,所以我一般不换液),直到传代,一直都不换液

我自己对照了以前的培养方法,步骤,培养基什么的都是一样的条件,猜想有可能的原因是:
1.pH值不合适,我现在的培养基pH是7.0。我以前用的是7.2,但是这个微小的差别会对细胞有这么大的影响吗?那么骨髓基质细胞培养的最适pH值究竟是多少呢?
2.细胞营养枯竭。但是我养过别的原代成纤维细胞,有的细胞6,7天不换液也就是不怎么增殖了,也不至于细胞发生这么大的形态变化,甚至最后死亡了。我也曾经试过在培养的第3天换液,但是细胞照样也会出现形态的改变,最终发展到死亡。
3.密度抑制。但是从图中你也能看到,这个密度最多只有70%-80%左右。我以前样的骨髓基质细胞,增殖到100%再传代也没有遇到过这样的问题。

恳请有过培养骨髓基质细胞经验的战友相助,我在这个问题上已经困扰一个多月了,试验一点进展也没有,都快对养原代细胞产生恐惧了!!!!帮帮我看看究竟是什么原因呀?

下面是培养骨髓基质细胞第三代的照片(形态,密度什么的都还算正常):


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下面是培养到第四天,没有换液,也没有传代的细胞(大部分细胞开始变成树枝状,像老了似的)


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下面是第五天的照片(细胞开始崩解了)


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来个倍数大点的


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我说的可能不对,但是可以大家探讨一下:
1)全骨髓培养法养原代可能会掩盖很多污染问题,因为全骨髓细胞里面含有完整的免疫链中的所有细胞,有可能会消灭原代培养中的细菌支原体衣原体污染,但是不可能彻底,所以随着传代,细胞越来越纯,失去了对细菌的抑制,平衡失去了,细菌或是支原体衣原体开始爆发,于是出现了如上的情况;所以还是用淋巴细胞分离液分一下单核可能更好一些
2)单单从楼主的第一张F3代的照片来看,状态并不很好,不太像很好的基质细胞(当然基质细胞种类很多),有的地方密有的地方稀;
3)养啮齿类动物的细胞温度可以适当放低,例如36度
4)你的细胞怎么看都是经历了恶劣的环境,瓶子是用的一次性的吗?有没有以前同学遗留的化学物质在上面?
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我采用的是玻璃培养瓶,泡酸以后使用的。如果说有个别瓶子没有洗干净有可能,但是最近养的细胞无一例外地出现这种情况,不可能每个瓶子都没有洗干净。我觉得可以排除这个因素。

你说的支原体污染的问题,请问除了用你所说的淋巴细胞分离液的方法之外,仅仅从原代培养操作的角度来避免,可以吗?你觉得从我的这个细胞的情况看,是不是支原体污染呢?(最近连着作了4,5次原代,每次传代后,总会出现这种情况,有的是传第一代就出现的,有的是传了四代以后出现的,不可能都是支原体污染吧)

园子里有的人认为原代细胞培养的48-72小时就应该全量换液,减少单核细胞的贴壁,不知道这个方法能否减少支原体污染的机会?

你说从图片上看来,细胞的状态不好,看着不像基质细胞。很多文献说随着培养代数的增加,细胞的纯度会有所提高。因为我对细胞本身纯度要求不是太高,对细胞状态的要求比较高,是拿来做转染的。请问细胞状态不好,培养的时候要注意什么呢?(比如培养基的pH值,消化的时间等)

可以试试降低培养温度。

急盼解答,谢谢!
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hold住[使用道具]
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战友啊,解答谈不上啊,大家都在层流间里挣扎罢了,讨论一下吧,我养细胞也曾经出现你这样的情况,所以深有感慨。就说说现在怎么解决吧,又看了一下你贴的条件,pH值是一个方面,我一般都调到7.15;但是如果你觉得没有污染,那么是不是血清质量不高?有一段时间我买的GIBICO的血清都不好。还有一个方面就是我一直用的是低糖的DMEM,培养的很好,有时低糖的没有了临时找一瓶高糖的就养不好。
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我这两天重新配了a-MEM,pH值7.2,用的还是Gibco的特优级胎牛血清,血清浓度10%。我再养着试试看,有机会再与群友们讨论。多谢!!
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我觉得是可能干细胞开始出现了分化,老化等现象。
血清浓度过高是影响干细胞分化的一个重要因素。特别是优等胎牛血清,虽然15%,个人认为其含有促分化的因子,故原代培养出来后,传代细胞的培养可以降低血清浓度,或者甚至可以逐步改成国产血清。个人意见,可能不完全对,供探讨!
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any333[使用道具]
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本人养的细胞也有这种情况出现。本人从事生物制品的质控领域。培养细胞快3年。
本人最近配置了一批培养基,用该培养基换液,结果该T75瓶细胞全部出现上述的“树枝”变化,且细胞生长缓慢,似乎停止生长,有细胞碎片出现,但培养基不出现浑浊等污染情况。上周五换液今天观察仍未见改变。而未换液的细胞无此变化。我用的培养基除了牛血清外全部是高压过的,而该批号的牛血清正是我未经过检定的,所以我怀疑是这批血清出了问题。
同样,用该批培养基做的滴定试验发现,96空板内的细胞也出现的上述变化,而且复舒后的T25细胞也有数瓶不生长。但很奇怪的是有瓶里面部分细胞生长正常,而部分细胞呈"树枝"状变化。准备明天传代或者重新配置培养基。
初步认为是出现的肉眼不见的污染,可能是支原体污染,但我还没有时间做支原体试验。而且支原体污染不像是这种表现,支原体污染细胞生长多比较正常,形态没有见过像“树枝”样的。
不排除有未知的病毒污染。
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