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标题:[求助]细胞转染后怎么成圆的了？

superboy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞转染后怎么成圆的了？


我的细胞转染48h后在荧光显微镜观察，细胞形态还正常，消化传代以后加G418做稳转，加药以后头两天看，细胞形态还是正常的，但是第三天开始就缩小成小圆点了，感觉就和加胰酶消化后的细胞形态，不知道这个时候细胞是死是活？我还要继续加药吗？还是重新做转染？
谢谢！！
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toy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况应该是细胞死亡的形态表现。建议仔细回想步骤，并查找文献，重新做转染
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果细胞转染后48小时还可以的话，一般不是转染试剂的毒性影响。
但是转染后的细胞传代时，状态会稍稍欠佳的
第二，加G418筛选是比较常用的方法，我觉得你是不是之前没有筛选出G418的最小致死量？园子里有帖子，搜一下就可以了。一般的是将用浓度梯度的G418筛选正常未处理细胞10-14天，选出10-14天内，将所有细胞杀死的最小G418浓度。由于不同厂商不同批号的G418这个阈值是不一样的，所以你必须做试验前筛出这个浓度。我觉得你G418浓度不对。还有，加入以后，细胞是会出现大量死亡。
加油哦
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，谢谢各位。
那为什么空载体的活的还很好？
我做了预实验确定的浓度
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toy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果不放心，可以重新做一次，但这次的不要扔，继续培养。有克隆就行。
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 toy 的帖子

哦，我再试试，有师兄说转染之后细胞就会变形的
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是G418起作用了，一般加入后两三天以后才会有细胞开始死亡，而且细胞在转染后的接种密度不能太大，否则还没等药物起到筛选作用细胞就会长满，如果转染没问题的话细胞经过十天后会有克隆形成的，我的经验都是CHO转染
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发表于 2012-5-29 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，按理说，转染成功的细胞对G418有抗性不会死的，可是我的都死了，到了第七天左右，我发现细胞愈来愈多了，没有荧光的细胞增加了。一个六孔板里只有2或3个荧光的细胞了。
注，转染成功48h时我消化按1：6传代了，操作过程中，我用力过大所剩细胞不多，我在荧光显微镜下看过，大多数是发光的，可是，加药以后就死掉了。活下来的，不发光，现在我一直没扔掉，让它长结果它们长得很好，就是没有荧光。哎，
郁闷，请高手帮帮忙
谢谢
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toy[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ls的，一般G418两三天以后有效浓度就只有原来的一半了
所以你要两到三天换一次液的。
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cocacola[使用道具]
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发表于 2012-5-29 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到过这样的问题，这就像是做单抗，得有耐心。
可以把你传过代且加了G418 存活下来的细胞，如果是贴壁的，可以铺上一层琼脂，然后在荧光显微镜下画出荧光的位置，把它挑出来再进行进一步筛选。
祝你成功！
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