血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

原 理
以醋酸纤维薄膜为支撑物,浸入pH8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上,电泳后,将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色,洗去多余染料。
操 作
1.准备与点样
(1)将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用铅笔划一线,以标明点样位置。同时在一端边沿写上实验者的学号或姓名。
(2)将薄膜无光泽面向下,漂浮于巴比妥缓冲液面上(缓冲液盛于培养皿中),使膜条自然浸湿下沉;
(3)将充分浸透(膜上没有白色斑痕)的膜条取出,用滤纸吸去多余的缓冲液,把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线架空。
(4)用血色素吸管吸取新鲜血清3~5ul,涂于载玻片末端处,或用载玻片在血清上蘸一下,使载玻片下端粘上一薄层血清,然后紧按在薄膜点样线上,待血清全部透入膜内,移开载玻片。
2.电泳
将点样后的膜条置于电泳槽架上,放置时,无光泽面(即点样面)向下,点样端置于阴极槽架上以四层滤纸作桥垫,膜条与滤纸需贴紧,待平衡5分钟后通电,电压为110V,电流为0.4~0.6mA/cm,通电1小时左右关闭电源。
3.染色
通电完毕后用镊子将薄膜取出,直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中,染5分钟取出,立即浸入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗数次,直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。
4.定量
本实验不要求进行定量分析,如有需要,可采用薄层扫描仪进行扫描定量,或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。
5.计算
光密度总和T=A+α1+α2+β+γ
各部分蛋白质的百分数为:

临床意义
1.正常值: 白蛋白57~72%     α1球蛋白2~5%        α2球蛋白4~9%
β球蛋白6.5~12%   γ球蛋白12~20%
2.肝硬化时白蛋白显著降低,γ球蛋白升高2~3倍;肾病综合症时白蛋白降低,α2和β球蛋白升高。
试剂与器材
1.电泳仪:包括直流电源整流器和电泳槽两个部分,电泳槽用有机玻璃或塑料等制成。它有两个电极,用白金丝制成。
2.巴比妥缓冲液,pH8.6,离子强度0.06
巴比妥钠12.76g,巴比妥1.66g于蒸馏水中加热溶解后再加水至1000ml
3.氨基黑10B染色液
氨基黑10B 0.5g,甲醇50ml,冰醋酸10ml,蒸馏水40ml
4.漂洗液配法
95%乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸馏水50ml 混匀。
注意事项
1.醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上电泳,主要是白蛋白偏高,个别正常人白蛋白仅超过70%。α1,α2,和β,γ都偏低,个别正常人γ球蛋白可低到12%左右。上述正常值仅供参考。
2.经电泳,染色之干燥膜浸于冰醋酸:95%乙醇(2∶8)溶液中20分钟,取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过程中,薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘出电泳曲线,并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜可长期保存,供教学示教用。
附:迁移率是胶体颗粒的一个物理常数,可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质。现将人血浆蛋白质的等电点,迁移率等列于下表,供分析参考。
人血浆蛋白质的等电及迁移率
蛋白质名称 等电点 泳动度/(cm2·V-1·S-1) 分子量
清蛋白 4.88 -5.9×10-5 69000
α1-球蛋白 5.06 –5.1×10-5 200000
α2-球蛋白 5.06 –4.1×10-5 300000
β-球蛋白 5.12 -2.8×10-5 9000-150000
γ-球蛋白 6.85-7.50 -1.0×10-5 156000-300000
纤维蛋白元 5.40 –2.1×10-5