[求助]腺相关病毒的包装问题

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标题:[求助]腺相关病毒的包装问题

tuomu45[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请大家分析下我的问题：本人用六孔板共转染（pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper）包装空载体腺相关病毒，转染后48小时在荧光显微镜下看，一个视野内约有80%的绿色荧光。转染后第三天，收病毒。再将病毒原液感染种在六孔板内293细胞，48小时后在荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白。
上述的过程，本人重复了三次。均未见绿色荧光蛋白。现在本人感到疲惫。请大伙帮忙分析分析。谢谢！
本人用脂质体2000转染，方法是：①转染前２４小时种板，②转染前一小时换液（用无血清的DMEM或有血清的DMEM；两种方法都用过），③转染：将三种质粒各1.33μg加入250μl无血清的DMEM；再将脂质体2000加入另一250μl无血清的DMEM内，静置５分钟；混合两者，静置２０分钟。然后以点滴的方式加在六孔板内。加毕，轻轻摇晃六孔板④六小时后，再次换液（含DMEM+10%FBS）。
收病毒的步骤：①转染后７２小时，用孔内的培养液将细胞吹下来，收于EP管内（２支）②将２支EP管先放入－７０度冰箱内约20分钟，再取出，放入37度水浴锅内约１０分钟。③反复冻融４次；④10,000g离心１５分，取上清液。
病毒原液感染的步骤：①将六孔板内的培养液吸出，加入上述的病毒液1.5ml。②感染后第二天，将液体吸出，换成DMEM+10%FBS；有一次感染时没有吸出原液。③感染后第二，三天，荧光显微镜下未见绿色荧光。
请大家帮忙分析一下，我的问题出在哪里。

loli[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper应该等摩尔比例转染

tuomu45[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢楼上的回复，按照说明书：１０cm培养皿分别需要三种质粒各10ug,有此推断应当是等质量的。另外文献也是等体积做转染的。
急，急，从春节到现在都是白干。郁闷！！

join[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们用的也是三质粒共转染体系，三者在直径10CM的培养皿中加的量是含目的基因的质粒10UG,RC10UG,HELPER15UG.

hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从你的操作看没有问题,我们做的很粗糙都可以的。
如果你的质粒肯定没问题的话应该考虑细胞的问题,以前我包腺病毒的时候用过四株293A有两株好用,然后再包AAV只有一株能出毒,为了细胞得事花了好长时间,感觉AAV对细胞的要求挺高,得先确认你得293起码能出AV,或者你找个已经证明好用得AAV系统再转你得细胞试试看看.

tuomu45[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢大家的回复。你们用脂质体转染还是用磷酸钙。为什么helper要加１５ｕｇ，要按摩尔比吗

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发表于 2012-5-30 11:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是应该等摩尔比的

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发表于 2012-5-30 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

STRATAGENE 公司的网站上有三质粒包装系统的详细的步骤及注意事项
你可以看看。

131415[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好,请问一下你的那个问题解决了吗?我目前也在包装AAV,和你情况差不多,每次在荧光下细胞看起来都是很多,但是纯化后再次转染293细胞后,却一点都看不到,很郁闷.请问你有什么好的想法吗?谢谢

moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问一下，你只看了荧光，有没有看到病变或空斑？
我觉得你这种情况问题不是出在转染上，你有80%的荧光说明载体是转染进入了细胞。但是第二轮无荧光说明载体转入但没有包装成病毒
所以我认为有两种可能性：
第一：你的载体腺病毒表达系统是否有问题
第二：你的293细胞是否有问题，换一株293试一下
个人觉的载体表达系统有问题可能性大一些

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