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标题:[求助]DMEM培养基配法

abc816[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]DMEM培养基配法



大家好，我最近要培养大鼠间充质干细胞，买的是Gibco公司的粉状DMEM培养基，想请教一下如何配成液体啊，说明书只写加3.7gNaHCO3,加纯净水至1升。有些养过的同学说还要加谷氨酰氨什么的，加的量大家都不太一致。请养过的朋友给点意见，大家都怎么配得啊，还有胎牛血清，加15％够了吧，谢谢啦
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BUK[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你用Gibico的新产品，MesenPRO RS™ Medium，专门为间充质干细胞设计，本人正在用，效果非常不错。传统的DMEM尤其是粉剂配制过程中PH值调节很容易造成不稳定，如果一定要用的话FBS最多加到10%，否则细胞分化很快。
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abc816[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢啦，我现在在做预实验，暂时先用粉剂试试，正式做时再改吧。还有用过粉剂的朋友吗，大家都来聊聊吧
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

记得还要调整PH值，最好在7.2-7.4之间，不过因为过滤过程中可能会出现PH值稍微升高所以调7.0-7.4都行
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

粉末培养基配制（以1升为例）：
3.1. 细胞培养基通常须添加10% 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

3.2. 材料：
3.2.1. 纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要）
3.2.2. 粉末培养基
3.2.3. NaHCO3（Sigma S-4019）
3.2.4. 电磁搅拌器
3.2.5. 无菌血清瓶
3.2.6. 0.1或0.2 mm无菌过滤膜
3.2.7. pH计
3.2.8. 真空泵
3.2.9. CO2气体

3.3. 步骤：
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空泵通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1或0.2 mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。（血清亦可加入培养基中一起过滤）。
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loli[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 将干粉型培养基溶于总量1/3的灭菌三蒸水中，再用水洗包装袋/瓶内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁性搅棒搅拌，补加水到最终量。
2. 根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3（一般3.7 g）和谷氨酰胺。
3. 加抗生素：最终浓度为青霉素100U/ml,链霉素100U/ml。一般市售的青霉素为80U/瓶，将其溶解在4ml体积内，每1000 ml培养液中加0.5ml,即成最终浓度为100U/ml。一般市售的链霉素为100U/瓶，将其溶解在5ml体积内，每1000 ml培养液中加0.5ml,即成最终浓度为100U/ml。
4. 上述溶液配制好后，用过滤法消毒去菌。采用0.22μm的滤膜。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。
5. 调整PH值，培养液的PH值要待加入血清后再作调整。
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abc816[使用道具]
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 小中大
谢谢各位帮忙，现在大概清楚了，我查到的资料谷氨酰胺加2.8g/1000ml,这个量对吗，还有人说新鲜配置的培养液可以不加，若放置时间过长，谷氨酰胺分解再追加，是这样吗？
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发表于 2012-5-30 11:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在一本讲干细胞的培养的书里面看到过，说DMEM的配置，实际上加入2.2g碳酸氢钠比理论的3.7g的碳酸氢钠要好。楼主可以试一试，先加2.2g，看看pH，如果还是偏酸，就继续加入碳酸氢钠。
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bongte[使用道具]
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发表于 2012-5-30 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"4. 上述溶液配制好后，用过滤法消毒去菌。采用0.22μm的滤膜。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。
5. 调整PH值，培养液的PH值要待加入血清后再作调整。"

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我想请教一下，血清需要过滤吗？我滤血清的时候很难下，你是怎么滤的呢？还有加完血清再调PH不会污染吗？
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star#room[使用道具]
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 小中大

我的protocol：
(1)将DMEM干粉(l3.4g)溶解于当日配制的三重蒸馏水(三蒸水)300mL中
(2)称取NaHCO32.Og及HEPES 4.8g〔缓冲能力比较强，可以使得培养基较长时间pH稳定〕溶解之后，加入上述培养基中，搅拌使之充分溶解，加三蒸水至1000ml
(3)用7.4% NaHCO3或1N HC1调整pH值为7.0～7.2（过滤之后pH升高0.2左右）
(4)0.22μm一次性滤器过滤除菌，分装于无菌的100m1玻璃瓶中-20℃保存
(5)临用前加入所需量的血清和双抗（终浓度100U•mL－1青霉素、100U•mL－1链霉素），混合均匀即可使用了。
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