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标题:[求助]关于细胞冻存和复苏

8s5g[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于细胞冻存和复苏


大家好！最近我的细胞复苏后总是出现问题。冻存是细胞状态很好。我是如下操作的，请大家帮忙看一下到底存在哪些问题：
复苏时：从液氮罐取出细胞后1min内在37度水浴化冻，置于超净台，我没有离心，将细胞吹开后移入装有完全培养基的培养瓶。（离心与否好像关系不大，隔天换液就可以去除DMSO）。
冻存时：我的冻存液是9:1的小牛血清+sigma公司的DMSO。细胞悬液离心用用冻存液吹打，置于冻存管，然后梯度降温：4度10min，-20度30min，超低温冰箱过夜，置于液氮罐。就是这样。
但是细胞复苏后就是不好，不知道为什么，请大家帮忙。
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

融化后的DMSO具有明显的细胞毒性，所以复苏要快，另外，冻存与复苏过程中难免出现死亡细胞，释放出来的内容物也具有细胞毒性，因此离心是必须的。
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8s5g[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是以前我没有离心的细胞也可以啊，就是这次的细胞不行啊！
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乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
供参考：
1、冻存液不要现配，因为DMSO现配可能会对细胞有毒性，
2、解冻时，要尽快将冻存管整体升温至37度，因此有人将其直接置于38-40度的水浴中，
3、复苏时，必须要离心去除DMSO，并用培养基洗涤1-2次。注意离心速度不要过快，1000rpm以下，我认为500-800为宜。
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

复苏当天不离心是可以的。离心对细胞的损害比DMSO本身对细胞的损害更大。24小时以后肯定要离心。
冻存液配置好以后有就没有预冷？
不要局限于冻存和复苏，多想想还有没有别的原因。培养基有没有问题？配置了多久？酸碱有没有变化？水质好不好？
我曾经复苏过ＨＬ－６０细胞，连着４、５次复苏失败，最后证实是培养基的问题。
另外血清可以加到２０％。
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newway[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
顺便请教一下冻存是为什么要加DMSO,它的作用是什么?
看了各位的说法,自己有些糊涂了,为什么复苏时可以不用离心,难道DMSO的毒性不会影响细胞的生长吗?
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发表于 2012-5-30 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而减少细胞损伤。
2、复苏时还是离心去DMSO的好。
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发表于 2012-5-30 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 配冻存液时由于DMSO在溶解的过程中放出大量的热量，应将其先与培养液混匀后再加入血清，混匀后再加入细胞。
2.对于比较难培养的细胞在复苏后应离心防止DMSO对细胞产生毒性作用，但是对于一些培养条件要求相对较低的肿瘤细胞可以不离心直接将细胞转入培养皿中培养，因为离心本身对细胞的数量和质量会造成一定的损伤，不过这还要在实际工作中摸索。
3.由于冻存管具有一定的厚度，在实际的复苏操作中可以将复苏用热水的温度调整到40-42度，这样可以缩短解冻的时间。
4. 在处理好要冻存的细胞后可以直接将细胞用厚棉花包好，放在泡沫盒中后放在-70度冰箱中过夜，次日再转入液氮罐中即可。
这是我在日常的工作中的一点经验，楼主可以参考一下。
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 小中大
细胞复苏后不离心是可以的。但复苏后细胞状态不好可能跟细胞的代数有关，特别如果是原代培养后冻存起来的细胞，在确定培养基，冻存，复苏等等条件没有什么问题的话。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞复苏时需不需要离心得视情况而定，
1、细胞种类：有的细胞可以不离心，有的必须离心。
2、冻存条件：如果冻存液是完全培养基+DMSO，则可以不离心；如果是血清+DMSO，最好离心。我在实验过程中就碰到过这样的问题，同一种细胞，有时不离心，复苏后状态挺好，有时状态就比较差。分析了一下，好象跟冻存液有关系。分析原因可能是：如果用血清+DMSO冻存的细胞，复苏时再加入完全培养基，血清的浓度会比较高（一般都会大于20%），可能会影响细胞生长。这种情况下，要么离心，要么用无血清培养基复苏，具体要自己实验。
我一般下午或晚上复苏细胞，不离心，第二天一早换培养液，去除DMSO，效果比较好。
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