[求助]腺病毒转染293细胞问题？

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标题:[求助]腺病毒转染293细胞问题？

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近几次做腺病毒转染时感觉，转染后的细胞形态都不行？不知道啥原因引起的。急盼各位大侠多多指点一下，谢谢！！！
过程如下：
病毒储存液滴度为1.5－－2.0×109 ifu/ml ，取10ul 加入10ml 含2％FBS的DMEM 培养基中，再将其加入一个75cm2 的细胞瓶中，其中的293密度为80％左右。37度 5％CO2 培养24h、48h、72h、观察CPE状况。可是结果都不好。
如图：加病毒72h后结果放大400倍

附件

2012-5-30 12:20

54302412.snap.jpg (55.73 KB)

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再附一张：24h 200倍的

附件

2012-5-30 12:20

66700507.snap.jpg (72.63 KB)

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再附一张：24h 400 倍

附件

2012-5-30 12:21

50390770.snap.jpg (60.64 KB)

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这次打算把病毒量减少为原来地十分之一再试试看看，会不会是我病毒量太多而引起细胞死亡的。

toy[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

基本上看不到病变的现象。第一张图看起来细胞象融解了，又两种可能，1.污染了；2.病毒感染过了收获时间，细胞融解，病毒颗粒被释放出来了。
如果你这不是重组后第一次感染，估计病毒的活性不太好。

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、污染：我最近做的几次培养基都还是澄清的啊，没有出现细菌污染时的混浊现象，就是加病毒之后三天，培养基就开始发黄了，这个时候细胞就浮起来了，形状就如的一幅图了。
2、病毒过了收获时间了.：在这之前我做过两次，两次结果都可见完全CPE，一次是4天收获，一次为6天收获。
我再发一张我两个月之前用同样地方法做的，腺病毒转染照片（病毒储存与－20度冰箱）。做法完全和这次一样，可是最近做了几次就是做不出这样的结果了！！继续等待指教！！谢谢！！
（转染后 96小时 400倍）

附件

2012-5-30 12:22

88527771.snap.jpg (50.86 KB)

pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据你上面的描述基本可以肯定是你病毒活性出现问题了。你最先的毒种看来没有问题，问题出在你那两次扩增把活性丧失了。一般腺病毒的收获时间应控制在48小时之内。再次，长时间保存应在－80度，并且要加保存液。要不最多也就2月活性会降低50％左右。

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在是准备用前两次扩增纯化出来的病毒，来进行293细胞转染从新开始扩增了.但愿结果会好一点啊！！
不过我病毒是分装的来用的，没存在反复冻融的，而且腺病毒保存是按照说明书上来讲的－20度保存的。但是没考虑得到活性会降低。
谢谢了啊！！以后多多指教啊？我是新手！！

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发表于 2012-5-30 12:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般腺病毒的收获时间应控制在48小时之内。

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不同的腺病毒收获时间不同的，pAdEasy系统就是10天

zzzz[使用道具]
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发表于 2012-5-30 12:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也在做腺病毒包装，第一次做很顺利，荧光不断增强，滴度还可以，这一次实验很差，脂质体转染14-18小时后，可见不少荧光，可3天后荧光就不再增强，后越来越弱，细胞脱落，第一次做的时候没碰到这种情况。有谁知道这是为啥？

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