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标题:[求助]annexin V检测凋亡

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发表于 2012-5-31 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]annexin V检测凋亡



最近，我用bd的annexin V凋亡试剂盒检测药物对细胞的影响，但几次结果都不理想，请各位战友帮忙分析一下原因！下面我把实验过程说一下：
第一次实验 分组：1 实验对照组（空白）
2 对照annexin V单阳组（不加药处理）
3 对照PI单阳组（不加药处理）
4 对照双阳组（不加药处理）
5 对照双阳组（加药处理）
6 实验一组（加药处理）
7 实验二组（加药处理）
加药处理24小时后，收集细胞，冷PBS洗一遍，加入1×结合buffer100微升（大约有5×10 5 次方细胞），然后加入annexin V 5 微升和PI 5 微升，室温避光15min，加300微升1×结合buffer，上机检测。当用前4管调补偿后，上第5管后，整个细胞群都移到了右上象限，导致调的补偿不能用，不知是什么原因，请战友帮忙分析！！！
重新调节后，检测后面几管（FL2电压只有280多），这几管细胞的分群也不明显，整个实验完全失败！是不是药物作用时间不够？？？我的操作步骤应该没问题，因为我做过别的细胞的凋亡，图很漂亮。
第二次实验
1 实验对照组（空白）
2 对照annexin V单阳组（加药处理）
3 对照PI单阳组（加药处理）
4 对照双阳组（加药处理）
5 实验一组（加药处理）
6 实验二组（加药处理）
情况与第一次实验基本相同，用前3管调补偿后，上第4管时，整个细胞群又向右上象限漂移，检测后几管细胞分群还是不明显。真是痛苦啊！请各位战友帮忙啊！老板催得紧！我到底应该用哪几管调补偿呢？加药处理的还是不加药处理的？？？

另外，简单说一下我的实验背景，我用shRNA干扰了某个基因，得到稳定表达株，实验对照组是阴性载体组，试验一组是shRNA1组，实验二组是shRNA2组。
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发表于 2012-5-31 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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发表于 2012-5-31 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

药物作用以后，对于一些细胞来说，其细胞形态与正常细胞比会有变化，因此做FCM时得作些微调，将其中正常的细胞群调整到相应的区域，然后做后面的分析。
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发表于 2012-5-31 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
药物作用以后，对于一些细胞来说，其细胞形态与正常细胞比会有变化，因此做FCM时得作些微调，将其中正常的细胞群调整到相应的区域，然后做后面的分析。

————————————————————————————

但是调整太大，这种补偿就没起到作用。继续求助！
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发表于 2012-5-31 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加入1×结合buffer和annexin V 5 ，最好室温避光标定15min，在上机前再加入PI 。
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发表于 2012-5-31 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我用加药处理的细胞调补偿，
1 实验对照组（空白）
2 对照annexin V单阳组（加药处理）
3 对照PI单阳组（加药处理）
4 对照双阳组（加药处理）
是不是实验对照组（空白）也应该用加药处理过的？还是用未加药的细胞？请大家帮忙！
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发表于 2012-5-31 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的凋亡图 不好.我用的是biovision的试剂盒.要先加500ul 的binding buffer再加两个染液.我是严格按照说明书的.是没染上吗, 另外离心把液体倒掉后,里面还有一点液体,有必要用枪完全吸掉吗,会不会损失细胞.如果不完全吸掉,是不是稀释染液.
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 小中大
biovision 公司的，我用过，效果很差，害我找了很长时间原因，因为不敢挑战这个公司的权威性，最后发现我买的这一批都不好，分群不开，于是我换货，后来说国产的就不错，比如晶美的，你可以试试，这个不贵，找到原因最重要了，有时候不能太相信所谓的权威
不过BD的应该可以，与仪器是一个公司的吧，机器负责人操作水平怎样，这也很重要

最后祝你试验顺利
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 小中大
今天又一次测了一下，最后由于死亡细胞和活细胞的annexinv-FITC染色效果一致而告失败，是非特异染多了还是***作问题，荧光显微镜下，二者都染上了色。今天头太疼了，明天仔细想想再请教大家。
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 小中大

我这里有Annexin V-FITC&PI 试剂盒，效果不错。可免费赠送20tests试用。如果有兴趣，请来邮件告诉我。
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