[求助]NFS60 细胞测定G-CSF 半数增长浓度

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标题:[求助]NFS60 细胞测定G-CSF 半数增长浓度

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在养nfs60细胞，是细胞因子依赖的，培养时加入G-CSF10ng/ml培养。用来测定商品G-CSF时先用培养液（不含因子）或冷PBS或生理盐水洗两遍，之后50000/ml 每孔180微升接种96孔板，预培养24h后加入不同浓度的待测因子，作用48h，每孔加入MTT20微升作用4h，加入三联液溶解过夜，570nm测定吸收值。发现control孔吸收值较大，达到0.7左右，之后改以20000/ml密度接板发现control孔仍有0.5左右的吸收，最大吸收只有1.4，与control拉不开距离，中间观察发现无因子的control孔并不出现死亡迹象，相反还有增长，接班后剩下的无因子细胞培养时也发现24h后不会出现死亡，甚至5到七天才出现大量死亡，但一周之后仍有相当数量的细胞存活，将饥饿5天左右的细胞按20000/ml接板后发现其反应性降低加入因子后没有显著增长。实验无法进行，还请过来人指点。是我的细胞出了问题？对因子失去依赖性？是否有人养过这个细胞，并测定G-CSF类药物，恳请大幅交流

nn255[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过这个，是完全按照药典做的，很顺利，你的方法和药典出入较大，建议你先按药典的方法操作试试，祝你成功！

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

control不死是正常的，它只是不能增殖而已，两天不会死的。你按药典仔细做试试，包括平时培养细胞时所添加的GCSF的浓度，药典规定是20ng/ml。

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yueban-1147 于 2012-5-31 13:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

control不死是正常的，它只是不能增殖而已，两天不会死的。你按药典仔细做试试，包括平时培养细胞时所添加的GCSF的浓度，药典规定是20ng/ml。

药典是怎么规定的啊能给出具体的出处吗谢谢

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是哪版的药典分部和页码？
另外想问问你们MTT具体怎么做的你们是用DMSO还是三联液（SDS,HCL,异丙醇）来溶解MTT的，是离心后吸取上清测吸光度吗？我的方法是180微升细胞，20微升药物，作用后，加入MTT20微升，4h后每孔吸出1oo微升，加入100微升三联液溶解过夜，发现细胞碎片聚集严重，集中在空的边缘，而且随着放置时间增加，吸光度大的孔值增加的更多，原本吸光度小的孔（如CONTROL）变化很小，不知道是因为时间增加结晶溶解更完全导致吸光度增加呢还是由于溶剂的缘故呢？请教各位？也愿交流一下大家的PROTOCOL

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 王蜜蜜 于 2012-5-31 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是哪版的药典分部和页码？
另外想问问你们MTT具体怎么做的你们是用DMSO还是三联液（SDS,HCL,异丙醇）来溶解MTT的，是离心后吸取上清测吸光度吗？我的方法是180微升细胞，20微升药物，作用后，加入MTT20微升，4h后每孔吸出1oo微升， ...

2005年版的附录里就有
是完全按照药典做的（和你的不同）
你去找药典吧

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 yueban-1147 于 2012-5-31 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

2005年版的附录里就有
是完全按照药典做的（和你的不同）
你去找药典吧

我看了没有相关的啊

yueban-1147[使用道具]
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