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标题:[求助]心肌细胞少 ，不贴壁？

xevin[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]心肌细胞少 ，不贴壁？



我养了一个阶段的心肌细胞，但每次做下来有时候细胞较多，但是24小时多还不贴壁，要么就是消化下来细胞不多啊
我把***作的大概步骤写下来，请各位养过心肌细胞的战友帮忙看一下，指导一下啊！急！啊
步骤：1.在无菌条件下，取5只1－3天的乳鼠心脏于pbs 中。
2.剪开心脏，取心尖部，于pbs 中反复清洗3遍后剪碎。
3.把碎组织块吸入离心管中加胰酶4毫升，轻轻吹打后水浴3－5分钟后去除上清液。
4. 于组织块中在加入含百分之0.125胰酶＋百分之0.02的EDTA 4毫升，轻轻反复吹打于水浴5分钟，在水浴过程中间隔摇动。
5.把上清液吸加含血清的培养液终止，组织块继续加胰酶重复第四步的操作。重复第五步操作。
6. 把中和的液体用800转离心5分钟。
7.去上清后加培养液吹打后吸入培养瓶中，进行差数贴壁1.5小时。
8.把差速贴壁后的含心肌细胞吸到事先用明胶铺的24孔板中。

但24小时后经常没看到好多搏动的心肌细胞，而且很大部份多不贴壁，48小时观察还是没好大变化的。 而且很大一部份没消化完全，镜下好大一部分是片状的心肌细胞组织，有些随换液体洗掉了。
在下已经养过好一段时间了 ，但不知道问题出在什么地方啊 ，望各位战友指导一下啊，不胜感激！ 真的很急啊！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你离心后的细胞有没有加到计数板上看密度什么的啊
最好台盼蓝染色一下
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xevin[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我计数过一次 不过当时细胞数不多，另外就是用胰酶经常消化不散那，我打算下次加胶原酶，希望效果如何啊 ！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该胰酶加胶原酶,这样消化效果好些,可以使心肌细胞损伤少些,胰酶的消化能力还是比胶原酶强些.
"很大一部份没消化完全，镜下好大一部分是片状的心肌细胞组织",既然这种情况,为什么不多消化几次,直到组织块消化完为止.细胞不贴壁,一般是数量不够,如果没有污染的话.
一定要在差速贴壁后对细胞进行记数,这样很重要,然后计算24孔板中,每一个孔中的细胞数是否达到了数量要求,这项很关键,直接关系到细胞是否贴壁
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abc816[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议楼主注意几个问题
1、单用胰酶消化就足够了，不要加EDTA（影响贴壁）
2、消化时尽量少吹打，会损伤细胞和过度消化
3、消化要完全，我有时会反复消化20次（整整3h，呵呵），前3、4次可能消化不完全（前2次消化上清丢弃），一般到第5次到15次会有较多细胞被消化下来
4、中和后马上离心，离心后加少量培养液重悬置于4度，等待全部消化结束一起再离心一次，避免胰酶影响
5、差速后200目不锈钢网过滤可以去除细胞团块
6、心肌细胞一般要24～48小时贴壁（可能与我不铺明胶或胶原有关），贴壁后24h即可看到心肌细胞成簇搏动，贴壁后很难消化下来
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xevin[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼上战友的提点 我也打算下次用胰酶加胶原酶试一下啊！希望能消化散一些！另外："很大一部份没消化完全，镜下好大一部分是片状的心肌细胞组织",既然这种情况,为什么不多消化几次,直到组织块消化完为止“ 每次我担心胰酶的消化能力太强，消化时间太长会把细胞损伤到，也是我每次以为不贴壁是不是因为细胞被胰酶损伤了的缘故啊！ 文献上写到每次消化10分钟，我才消化5分钟，才导致好多没消化完全那，不知你每次消化大概好多分钟？一般大概把组织消化完全大概好多次啊 。我每次多好像没什么耐心，只消化个4－5 次就算了。不知消化太多次，会不会后来消化下来的细胞已经受胰酶损伤了啊！
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abc816[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4、5次肯定不够，并且前两次混有很多杂细胞。消化到最后也不会损伤，因为消化完全的细胞已经进入消化液被吸走了，剩下的组织块总是消化不完全的，打个不恰当的比喻，就像卷心菜，剥掉外面一层才看得到里面的一层。我曾经试验过收集前10次（不含最初的两次）和后10次消化所的细胞分别培养，并无明显差别，每次消化时间5～10min，一般前面长些，沉淀少了就短些，胰酶用量也是如此。离心1000～1500rpm 5min每次都一样，最普通的国产台式离心机。每次消化结束要立即加培养液终止并离心去除胰酶，另外所用各种溶液pH7.2最佳，超过7.4也会影响细胞活力（因消化过程较长pH还会有所上升）
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ALALA[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“镜下好大一部分是片状的心肌细胞组织”
晕死，一定是没有过筛网吧，记着消化后一定要过200目筛网，回去看看你的实验步骤，是不是没看到这条啊。。。
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xevin[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢上面各位好心战友的提点啊，今天下午我在做了一次心肌细胞原代，用了胰酶加胶原酶共同消化，把前面时间增加到7－8分钟。开始前两次消化感觉细胞消化下来不多，而后随着次数的增加，消化下来的细胞越来越多，上清液还相对比较混浊了啊，差速后看细胞比以前多了。不过还是有好些没完全消化开来。在消化过程中出现了一个问题： 消化的一部分组织变成絮状黏稠样漂浮起上清液中沉不下去。在每次吸上清液的过程中一不小心就吸上来了。我是等把中和后在吸取出来重新消化，但感觉每吸就会把一大不分的中和液吸上来不好在重新消化。但感觉如果用细胞筛筛的话絮状黏稠样－可能还是含有好大一部份心肌细胞就会粘到细胞筛上，无形当中损失了好多细胞了啊！我每次做5只老鼠，本来细胞量就有限了啊！不知战友们是用什么方法解决的！静盼佳音啊！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们学校3个做心肌细胞的，我问了问他们，都有这种絮状物的情况，我也有，我们觉得这个絮状物就是心肌之间的粘连蛋白，很有可能就是胶原，所以没有再消化的必要了，我们的一致做法是----滤之。。。
另外一次5只乳小鼠太少了点吧，我一次都是20-30只，还有人更多。不行就自己养阿，自己养一次也不只5只，一窝都有十几只呢。。。
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