[求助]细胞裂解

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标题:[求助]细胞裂解

lagua123[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用六孔板做细胞转染,转后要做western blot检测,今天裂解转染后的细胞时直接往六孔板的每个空中加入了400微升的细胞裂解液,收集离心后未见沉淀,不知道用裂解产物做western blot蛋白含量够不够,第一次接触这方面的实验,请有这方面经验的朋友多多指教,谢谢!

hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

六孔板中加入400微升裂解液太多，这样会使你得到的蛋白浓度过低，满足不了Western blot上样的需要，我第一次做这个实验时，就犯过相同的错误，因为Western blot对一般蛋白的检测均需要上样40 ug，而上样的体积又是有限的，所以提蛋白时应尽可能的使蛋白浓度高。因此，我通常采用的方法是：先弃去培养液，用冰PBS洗3次，然后用细胞刮将细胞刮入1.5 ml EP管中，低速离心，去上清。若是六孔板的一孔细胞，在沉淀中加入80 ul裂解液即可，然后充分吹打，置于冰上裂解15 min，离心。
但是，我觉得有无离心沉淀跟你加入的裂解液体积无关，离心需用12000 rpm × 5 min，不知你的转速达到没有，先测测蛋白浓度再说吧。
如果你的样品比较珍贵，可以考虑用Mini型蛋白浓缩柱进行浓缩，我以前见过的最小Mini柱的规格是 5 ml的，对你不适用，但是现在有1 ml的Mini柱，你可以查查。

00无名指00[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

六孔板最多加200ul裂解液，可以用细胞刮，先低速后高速，高速我采用4度12000转15min，其实在整个过程中温度很重要，我习惯把所有物品提前置冰块中，在放入4度冰箱，然后拿出实验，而且我在取细胞也在冰上，配裂解液临用临配，而且在冰上配，将ep管置于冰中，裂解我也是把离心管置冰中，然后塞入4度冰箱，15min。

xue258[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可否告知你们用的细胞裂解液的配方？我想用它们裂解细胞后测一下酶（酸性磷酸酶）的活性，不知道这有影响吗？谢谢你们！

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2012-5-31 15:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可否告知你们用的细胞裂解液的配方？我想用它们裂解细胞后测一下酶（酸性磷酸酶）的活性，不知道这有影响吗？谢谢你们！

我裂解蛋白是用来做western的，那么裂解液里面就需要加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，而你测的刚好是碱性磷酸酶，因此不能使用一般的western细胞裂解液。我的western细胞裂解液配方如下。你删去其中的蛋白酶和磷酸酶抑制剂就可以用了。
20 mM Tris-HCl pH 7.4
150 mM NaCl
1% Triton x-100
0.1% SDS
1%脱氧胆酸钠
1 mM EDTA (蛋白酶抑制剂）
1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
1 ug/ml aprotinin（蛋白酶抑制剂）
1 mM Na3VO4 (磷酸酶抑制剂）
另外，如果你们实验室有超声破碎仪的话，我还有一种更简单的建议方法，我测细胞中的葡萄糖醛酸转移酶就是这样破碎细胞的：倒去细胞的裂解液后，用冰PBS洗3次，然后用Ep管低速离心，去掉大部分上清，重悬细胞，然后超声（将超声转头伸入细胞悬液中）1 min ×2 次，2次之间间隔30 s，这个操作最重要的就是低温，因为超声时产热量大，需将Ep管插在冰上进行超声，间隔30 s也是这个原因。

xue258[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

实在非常感谢！它们对我都是非常有用的资料！

我还有几个个小问题：Pureflat 你在测细胞的葡萄糖醛酸转移酶时，是不是先把细胞养至贴壁再测？还是从组织块得到分散的细胞而测定？你用PBS洗时的离心转速是多少？“倒去细胞的裂解液”是不是指离心弃上清？此外，细胞刮你是从何处购买的？谢谢你！

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发表于 2012-5-31 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 我养的细胞本身就是贴壁细胞，所以是在其中加入药物后，用细胞刮刮下来的。如果你需要测组织中酶的活性就更简单了，可以直接用匀浆器对组织匀浆，测定蛋白含量，然后加入酶的底物。
2. 细胞用PBS洗涤时用的是1000 rpm x 5 min。
3. 不好意思，“倒去细胞的裂解液”是笔误，应该是“弃去旧的培养液”。
4. 我的细胞刮是找经常联系的试剂商买的，由于包装袋被我扔掉，不知道厂家，这个东西很常见的，找你经常联系的试剂商就行了。我在武汉，如果你也在这的话，我可以提供电话。

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发表于 2012-5-31 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我前几天做了预实验。没有买到细胞刮，因此使用的是胰酶消化法，将贴壁的细胞收集下来。1000 rpm离心后加入缓冲液，直接超声破碎仪破碎细胞后检测细胞的溶菌酶和酸性磷酸酶活力变化。结果不大理想。因此我想请教Pureflat兄几个问题：

1、检测酶的活性变化对培养的细胞数目有要求吗？如果细胞数目太少，会不会导致测不出？
2、细胞裂解液与超声波破碎，他们的目的是不是都相同的？即把细胞裂解，释放出里面所含的酶液？我们实验室有超声破碎仪，我可不可以把细胞裂解液省略了？

1、是的，对细胞数有要求，因为要达到一定的蛋白量才能测出酶活性，你可以在蛋白裂解后，测定一下蛋白浓度。我一般用的是6厘米的培养皿。
2、是的，目的相同。所以用了超声就不需要用裂解液了。但是注意，超声会大量散热，所以一定要在冰上进行。

moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-5-31 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们用的裂解液比较温和依然要用超声
用超声的话可以替代裂解液吗？那至少也要在含有甘油和蛋白酶抑制剂的缓冲液里进行吧，一下1min狠点儿了，10s-20s一次，间隔10s置冰上降温比较好，或是干脆超完一次用手试试温度，别温了就行
离心还是13000rpm，15min，4度
不过有时候好像还是有脂样的东西，不知有没有高手知道是虾米东东

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