[求助]启动子片断插入到了pgl3basic载体中,...

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标题:[求助]启动子片断插入到了pgl3basic载体中,...

am10[使用道具]
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发表于 2012-6-2 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我把一个基因的启动子片断插入到了pgl3basic载体中，但是却没有测到荧光。阳性对照，即Pgl3 control检测到荧光。
推测：
1、启动子片断错误。
1000bp，已测序验证，在ATG前40bp，推测离转录起始位点还有200bp以上。
2、细胞的转录效率太低。
但是Pgl3 control和TK值都在10万以上。
3、细胞内的因子没有启动启动子活性。
启动子和转染的细胞不是同一个物种，但是大家好像都这样做的，并没有什么问题。

请各位做过这个实验的提点意见，现在正在困惑中。先行告谢。

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-6-2 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室一直在从事此方面的研究工作，所以看到pGL3-basic感到格外亲切，呵呵。可能原因分析：
1、结合已有的文献分析所选定的上游调控序列是否为该基因的核心启动子区，是否包含基因转录所需的元件；
2、细胞转染效率低这方面的影响可能并不能完全排除。因为pGL3-control是含有SV40的强启动子和增强子的，而构建质粒luciferase上游转录起始效率不好说，也就是说在转染效率不高的情况下可能能检测到pGL3-control的发光，却检测不到构建质粒的发光；
3、启动子和转染的细胞并不要求必须是同一物种，我们做的也有人和小鼠的；
4、排除细胞转染过程中的影响。

多多交流！

am10[使用道具]
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发表于 2012-6-2 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个星期换了IB细胞做了一下，发现我构建的两个载体发出的荧光的数值在800左右，空白荧光100左右，pgl control 得出的值在10万左右。
载体的浓度是基本一致的。
请问各位，800左右的值相对于pcl control 只有 1/100 正常吗？

guagua[使用道具]
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发表于 2012-6-2 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

启动子上下游你怎么选的? 转录起始位点下游多少碱基?

am10[使用道具]
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