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标题:[求助]关于细胞凋亡检测！

xyw5[使用道具]
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发表于 2012-6-6 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于细胞凋亡检测！



我马上就要做凋亡检测了，但看了好多文章有的用试剂盒结合荧光显微镜，也有的用流式细胞仪，还有试剂盒结合流式检测的。我想知道如果不用试剂盒，可以直接用流式检测，岂不是很经济吗？因为试剂盒都很贵啊！另外做凋亡检测和细胞周期分析前，必须要使细胞周期同步化吗？
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-6-6 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

流式检测并不适用于所有的细胞模型。准确一点说，不适合大部分的细胞模型，因为胰酶消化和吹打易使经受凋亡诱导处理后的细胞群发生明显的假阳性和假阴性变化，不管出不出得来结果，结果都是不可靠的。
严格来说，只有本身就是单细胞悬浮状态的样本才适合做流式凋亡检测，因为没有胰酶消化和机械损伤的影响。
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发表于 2012-6-6 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
流式检测并不适用于所有的细胞模型。准确一点说，不适合大部分的细胞模型，因为胰酶消化和吹打易使经受凋亡诱导处理后的细胞群发生明显的假阳性和假阴性变化，不管出不出得来结果，结果都是不可靠的。
严格来说，只有本身就是单细胞悬浮状态的样本才适合做流式凋亡检测，因为没有胰酶消化和机械损伤的影响。

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可目前凋亡的检测中很大一部份还是通过 FCM完成的，其实为避免实验操作引起的变化，设立详尽的对照组即可。
一般凋亡分析除PI的细胞周期分析外，还是建议使用现成药盒吧。这视你选择时间与金钱哪个更重要。
另外，我认为对于凋亡分析，细胞并不需要同步化的。
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guagua[使用道具]
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 小中大
请检索一下细胞类型，而不是文章比例，大部分细胞类型的凋亡没有使用流式检测。
除了悬浮生长的细胞（部分肿瘤细胞类型）和血液、淋巴系统细胞这些天然单细胞悬浮的类型，还能出现在文献上的其它类型细胞实际上其凋亡流式检测数据多数来源于非主流数据，什么意思？做十次“成功”不到五次，但是不要“失败”数据，只对“成功”数据进行计算和分析。为什么“成功”率这么低？为什么数据漂移这么剧烈？因为这是必然的！胰酶消化和机械吹打的损伤程度谁能够每次每个样本都做得近似（想都不要想“完全”了）一样？就算无聊得很一样了，设立对照能消除吗？假阳性是什么意思？怎么产生的？是非凋亡细胞被处理过程影响而产生的。假阴性呢？是凋亡细胞被处理过程影响而产生的。对照样本本来就基本没有凋亡细胞，假阴性率能和凋亡样本一样吗？不一样怎么能通过对照消除呢？凋亡样本本来正常细胞就少，剩下的都是比一般细胞更能耐受制备过程损伤性处理的细胞，假阳性率能和对照样本一样吗？不一样怎么能通过对照消除呢？假阳性和假阴性一起发生呢？你没有听04年Snow的讲座，他在这个方面的阐述是比较清晰和深入的。实际上到目前为止，没有一个专家敢说用对照就可以消除细胞制备过程对原始凋亡状态的影响。
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发表于 2012-6-6 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
文献怎么报道是一回事，我们自己做这个的，对自己的实践经验应该有专家级别的信心，这不是哪一篇文献里面对流式知之甚少的研究生或者老板能比拟得了的。
我有充分的经验，我就敢在看文献的时候不屑于流式这部分的层出不穷千奇百怪的错误，而不是有多少篇文献报道就信以为真。
关键的，好好把流式玩熟了，既要知其然，更要知其所以然，精雕细琢才能出细活。
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发表于 2012-6-6 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果照楼上所说，其实悬浮细胞也不适合做流式凋亡检测的，因为避免不了离心、洗涤、离心等可能引起细胞损伤的操作，及对细胞有毒性作用的PI等染料，还有在检测过程中激光对细胞的照射，等等。
个人认为，凋亡检测只是要个相对值，仅以反映药物作用的相对强弱。具体是怎么引起凋亡的，那需要大量的进一步的分析。
其实，任何分析检测手段多是得到的相对的结果，则是尽量减少非考察因素对结果的干扰而已。
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发表于 2012-6-6 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

严谨并不意味着绝对化。
不是只考虑消化和吹打的影响，而是其它步骤例如离心和洗涤只要不是明显的操作失误（1000rpm搞成2/3000rpm等等），对凋亡状态的影响远小于消化过程。在整个细胞样本制备过程中，不管消化和吹打如何规范化、没有操作误差，其固有的对凋亡状态的影响也是最明显的，这是步骤本身的特点决定的，跟操作误差不误差、规范不规范没有直接联系。
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发表于 2012-6-6 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也在用FCM做贴壁细胞的凋亡分析，结果让我很郁闷，每次都是不一样的结果，可重复性很差！我个人也觉得消化的吹打过程对细胞影响肯定很显著的，而且不同药物处理组的细胞状态不同，正常细胞或许能耐受消化和吹打过程，可药物处理组的细胞未必如此，尤其是高浓度的药物处理组的细胞。

在消化后离心我发现高药物浓度组的细胞离心下来明显要比其他组的细胞要少的，那这些细胞都去哪了？另外在加药后的不同时间点，在晚期我在显微镜下能看到细胞状态很差也边稀疏了，甚至细胞有一部分悬浮上来，所以我现在只是用FCM做了早期时间点的凋亡分析，也并没有我想象中的结果。我不知道在晚期的时间点上是否还可以用FCM还测定凋亡？
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-6-6 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果绝对凋亡试剂盒太贵，我可赠送20tests的Annexin V-FITC&PI以供预实验或练手。邮箱：请PM联系，不要留联系方式！

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我正准备做调亡方面的实验，对Annexin V-FITC很感兴趣，不知道哪个公司的Annexin V-FITC比较好，价格如何？如果能馈赠的话就更好了，感激不尽！谢谢！
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toy[使用道具]
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发表于 2012-6-6 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是不用流式而用凋亡试剂盒染色的话，是不是存在很大的主观性？因为不同视野的凋亡比例、程度可以有很大不同。同一个孔/片子里面不同视野的结果就天壤之别。请问这个问题如何解决？谢谢！
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