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标题:[求助]请问培养细胞如何匀浆（不用裂解液）

BUK[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请问培养细胞如何匀浆（不用裂解液）



请问大家培养细胞如何匀浆啊，我要提线粒体，不能用裂解液，只能用匀浆器，但不知用匀浆组织的匀浆器行不行啊？急求回答，不胜感激！
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以，就是所谓的douncer，不过不要像匀浆组织的那么大，太大会损失很多
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101010[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以我们实验室就是这样做的。下面是我们实验室的方法：

细胞弃去培养液后，用细胞收集液作用2到3分钟，用scraper,将细胞收集起来，6000g,离心15分钟。弃上清，之后加细胞匀浆液，用匀浆器或手动匀浆管匀浆，之后按要求离心。

细胞收集液配方：PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)
匀浆液配方：（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）
祝实验顺利！
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一点，匀浆过程中一定要保持低温。
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ending[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以尝试一下超声的方法
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

超声破碎应该可以，不过，在过程中一定要保持低温
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

超声破碎,调好频率,5-6次就可以了,在显微镜下观察,全是细胞碎片就ok了
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yysr238[使用道具]
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发表于 2012-6-8 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有问题，可以用组织匀浆器的。
我们学院的本科生有这个实验，是提取大鼠肝脏的线粒体。
把鼠肝（约1克）用生理盐水清洗两三次，然后剪碎，用预冷的0.25M蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9 ml预冷的0.25M蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0℃~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(尼龙丝袜也可以).
将0.34 M蔗糖溶液4.5 ml放入离心管，然后沿管壁加入4.5 ml鼠肝匀浆覆盖于上层(缓慢加)。用冷冻离心机按10000×g离心10min，沉淀（里面有线粒体）用0.25M预冷的蔗糖溶液10mL洗涤(10000×g离心10min，重复洗涤两次），所得沉淀里面就有线粒体，可以涂片观察
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toy[使用道具]
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发表于 2012-6-8 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是要匀浆细胞,说明书上说要DOUNCES匀浆器,但是我们实验室没有,我打算用匀浆管试试,你的现在成功了没有
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-6-8 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞的话最好用超声，组织用匀浆器
用PBS洗一遍，然后加适量PBS（根据你需要的细胞浓度而定），用细胞刮刮下，转移到1.5ml的EP管中，超声10次，每次1～2秒。
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