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标题:[求助]DC培养新问题：培养基选择，血清添加...

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-6-8 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]DC培养新问题：培养基选择，血清添加...


大家好，我正在养人外周血单核细胞来源的DC，之前作了点预实验，不是很理想，有些问题贴子里没找到，或说法不一，想请教正在养DC的朋友们的经验之谈

1用什么培养基？1640,IMEM，DMEM这几个你们用了哪个效果好，需不需要专门买进口的培养DC的培养基，还是自己实验室配的普通培养基就行。

2培养的时候需要加血清吗？FCS还是人AB的，好像这方面说法不一，请大家说说自己的经验吧

3粉末状的IL-4，GM-csf用什么融解分装最不影响活性？
无血清培养基还是PBS还是别的？我想分装后冻存一部分。

4细胞因子用量
我们这边有人都用20ng/ml养的效果还好，我很惊讶，好像说的都是100－200ng/ml,你们都用多少量呢,效果怎么样？

谢谢各位!
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-6-8 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢
1，你们接种单个核的时候是以什么密度接种，
2，培养器材一般用6孔板还是培养瓶，
3，细胞因子是先加培养基中还是换液时单独用微量枪加，
4 诱导培养DC过程中有什么需要特别注意的地方？
谢谢！
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-6-8 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一点，你们用这种方法培养的得率多高？作成熟和不成熟得表型如何？
谢谢！
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101010[使用道具]
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发表于 2012-6-8 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.收集单个核细胞.调节细胞浓度为106/mL,
2.然后在6孔板上贴壁,每孔加2mL,孔板对细胞吸附性好些
33h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，
4.用枪使用不同的枪头分别加入细胞因子
5.主要是熟练操作，无菌观念和规范的操作，一个小的细节能影响全局
DC获得率（％）约为9%
DC纯度（％）约为80%
成熟所需时间7-9天
成熟表形CD83 90%,CD40 40%, HLADR90%,CD80 85%,CD86 85%.
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-6-8 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢楼上，让我对培养又清晰了很多。
还有几个问题不明白
1用枪补加细胞因子的话不是每次加后都要混匀一下培养基吗，这样不是更影响下面生长的细胞？好像细胞动它越少，它会长的越好。
2你们是几天半换量，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL 吗？每次吸出一毫升培养基又不影响下面逐渐漂浮起来的细胞会不会觉得有难度？
3第几天开始加TNF-α ，促成熟只加这一种细胞因子就够了吗，还是要再加其他一些因子比如IL-6,LPS？

谢谢！
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发表于 2012-6-8 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外刚看了你回别人的如何配细胞因子的帖子，又想到了一个问题
4，用一般离心EP管的小离心机。装有粉末细胞因子的试剂管离心多少转几分钟?
谢谢！
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 小中大

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发表于 2012-6-8 13:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是做DC和imDC培养的，看了你们的帖子，受益非浅！能否给给你们的电话或邮箱，以便我能和你们交流
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zranqi_1[使用道具]
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 小中大

请问GM CSF 50 IL-4 用的是ng还是ug，怎么有的文献是ng有的是ug,而且剂量都不一样。请多指教
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junhun[使用道具]
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 小中大

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