[求助]不同药物浓度干预细胞的预实验怎么做呢？

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标题:[求助]不同药物浓度干预细胞的预实验怎么做呢？

star#room[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是刚开始做试验的，想做“不同浓度的A药对B细胞的代谢影响方面的东西

现在药物的浓度梯度不知道该如何确定，查文献查来查去都没查到。
而且我想把实验的药物浓度和临床的用药剂量相关
有人说 “直接用血药浓度作为实验浓度就行”，请问这种说法对吗？

请问各位前辈，应该怎么确定实验药物的浓度梯度啊？

还有，预实验应该做些什么呢？除了MTT测细胞的活力外，是不是所有的设计的实验项目都要作呢？

先谢谢前辈了！

caihong[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先不可以直接用血药浓度来做为细胞实验的用药浓度，体内环境和体外培养的环境有很大差别，不是一致性的关系。临床用药浓度还需要在细胞学实验基础上，进行动物学实验，涉及药代动力学方面。
细胞学的预实验至少需要做好这样几方面准备：
1 用一段时间熟练细胞培养的常规操作，养好细胞，熟悉细胞的特性和习性，做出细胞生长曲线。
2 确定药物效能，包括量效关系和时效关系。药物剂量即浓度的确定，从大的范围向小范围缩小，如第一次实验选择：0，0.001mM，0.01mM，0.1mM，1mM，10mM做六孔板实验，比如发现在0.01-0.1mM范围内起效，则进行第二次实验，浓度选择：0，0.01mM，0.02mM，0.04mM，0.08mM，0.1mM做六孔板实验，根据结果再做调整和选择。
3 实验实质内容的初步测定。比如药物影响细胞代谢方面的具体机制或方式及分组等的初步探究性实验，为正式实验的具体分组和检测指标的选择与测定做好前期工作。
先想到这些，希望对你有帮助。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以用MTT法来筛选药物浓度。例如将细胞浓度调整为5*104，用96孔板，根据药物特点如单体还是中药提取物等，如为单体，一般情况下因其作用较强，可从10ug开始，20ug，40ug，80ug，160ug依次类推。如为中药提取物，因其成分复杂，可能有效成分作用少，一般剂量较大，可从100ug开始，200ug，400ug，800ug，1.6mg，依次类推。因MTT发快速，简便，价格低廉，可重复数次，用于药物浓度筛选比较可靠。等筛选出有效药物浓度时，就可用其作为参考，做下一步实验了例如爬片作免疫组化等，如果预实验结果满意，便可以深入进行实验了。如此，即节约经费，又省精力和时间。

fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你应当首先查找文献，看看有没有既往相关的人或者是相关动物的用量情况，可以以其给药剂量为依据，再按相关人与动物体表面积工式来换算，再用于细胞培养。如果没有既往的资料可查，那你的工作就比较麻烦了，就是算通过预实验确立一个最低有效剂量，再确立一个最大致死量，以这个区间每隔一定比例（如1/9）来设立变量值，再研究其对细胞代谢的影响，先确立一个最佳的给药剂量，但是，如何测定药物的浓度，就比较麻烦了，你要用高效液相色谱，质谱，或者是气质联用，动态的监督其血药浓度，取血药浓度达最大值时的浓度代表某剂量下的浓度，再以换算后的浓度用于细胞培养。因为药物的血药浓度和其药效往往是如影随形的，也就是说当血药浓度达最大时，药物的作用效果也往往达到最大（多数情况下，尤其是植物药），所以，如果你没有条件应用色谱分析动态的监测血药浓度，以MTT法，也不失一个好的办法，只不过不够精确罢了。等你应用MTT法做完预实验，发现了药物的半衰期，最佳给药剂量和该剂量下的血药浓度，你下面的工作就相对轻松了，你只需固定剂量以后，单纯研究血药浓度就可以了。预实验可能会比较麻烦。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的经验是
1.先查相关文献,确定有效作用浓度,再以此为中心,按10倍设定等比浓度梯度,进行MTT检测,作用时间点可按文献及经验确定(一般是按24h、48h、72h)，也可每隔一段时间在光镜下观察，根据细胞形态的变化确定MTT检测时间。
2.如果没有相关文献可查的原创，建议以1uM为中心，按10倍设定等比浓度梯度（以10个浓度为宜），进行MTT检测，作用时间点的选择同上。如效应强，则相应下移浓度中心设定等比浓度。直至找出IC50为止。再以IC50为中心，根据药物的作用效果，重新设定浓度梯度（如2倍、4倍、8倍等），以4-5个浓度为宜，使效应曲线上最大浓度与最小浓度间差别明显，且IC50位于中间。
希望对你有所帮助。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充一点
筛选出合适的细胞浓度也很关键。
以细胞浓度5*104为中心，设几个细胞浓度，至少培养4天，每天测MTT,以保证你的细胞活力在实验期间呈线性。

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发表于 2012-6-8 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2012-6-8 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充一点
筛选出合适的细胞浓度也很关键。
以细胞浓度5*104为中心，设几个细胞浓度，至少培养4天，每天测MTT,以保证你的细胞活力在实验期间呈线性。

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请问，为什么以5*104的细胞浓度为中心啊，有没有文献依据啊？请指教。