液相色谱

HPLC应该怎样选择柱子？比如类型，长度等等

现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但

是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。



1、正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团

(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。

   

由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品

中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿

（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene  Chloride）等。

2、反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有

更强的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。



二、聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～

14均可使用。

相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白

质等样品的分离非常有效。

现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。



三、其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的

用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基

键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基

键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由

于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，

氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，

新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应

用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难

度，其重要用途与优势尚在进行中。





怎样选择填料粒度



目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、

5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填

充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，

但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料

是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，

3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更

短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使

用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。



一、如何保证良好的柱性能与柱寿命

◆ 认证阅读色谱柱使用说明书；

◆ 使用填充良好的色谱柱；

◆ 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；

◆ 使用保护柱及在线过滤器；

◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱；

◆ 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；

◆ 用稳定的固定相（C18最稳定）；

◆ 在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；

◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃；

◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；

◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；

◆ 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；

◆ 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。



HPLC固定相及应用范围

名称    别名       功能基团   正相  反相  离子对  应用

Silica                      -OH            √                          非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。

SAS    C1              -(CH3)3                √                 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最

                                        弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.

Butyl   C4               -C4H9                  √     √        分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。

MOS   C8，          -C8H17                  √     √       中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，

           Octyl                                                            极性药族化合物和环境样品。

ODS   C18             -C18H37               √      √       烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广

                                        泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.

CPS   CN ,Cyano   -(CH2)3CN      √     √           对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相

(propyl         
;                                              分离，当用于反相系统时，其选择性与  C8和

Nitrile)                                                        C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应

                                 用广泛。

APS   NH2             -(CH2)3 NH2     √     √          反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交

         (Amino Propyl)                                               换 ，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性

                                        剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂

                                        不同,分析芳香族效果很好。

Phenyl                     -(CH3)C6H5              √     √  芳香族化合物

Diol                         -(CH2)2O       √     √       反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择

                               CH2(CH2OH)2  



;                               性 相似,但极性较弱。

SCX  强阳离子     -(CH2)2C6H4SO3H-             √  有机碱

交换

SAX  强阴离子     -(CH2)3N+(CH3)3　　　　　　  有机酸，核苷和核苷酸

交换

液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：

一、反相色谱柱的选择
1．柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或 Zorbax的PH2-11.5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱
戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的 Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）



二、液相色谱柱的使用

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

三．色谱柱的维护

1.色谱柱的平衡
　反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：
a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

2．色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

建议用来冲洗柱子的溶剂体积
　　色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
　　125-4mm1.6ml30ml
　　250-4mm3.2ml60ml
　　250-10mm20ml400ml

选择再生方法：
　　极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：
　　正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
　　非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水

注意：
a.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b.0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

3.色谱柱的维护
a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
c．避免流动相组成及极性的剧烈变化
d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题



1.保留值与分离度重现性不好原因分析



问题                             原因                      表现

不同色谱柱间差异          填料、键合相不同            保留因子（k），分离因子（α）

使用期间柱变化              柱床破坏                             柱效（N）

                     键合相丢失                         保留因子（k），分离子（α）

                     硅胶基质溶解                     柱效（N）

                     强保留分堆积堵塞             保留因子（k），柱效（N）

柱外效应                          系统差异，进样量大、   柱效（N）

                     进样阀与   色谱柱之间、

                     色谱柱与检测器之间管

                     路太长、检测器流通池

                     体积大、接头死体积大

                     等。

分离效果变差                  流动相组分改变                保留因子（k），柱效变化很小  

                     流速改变                            保留因子（k），分离因子（α）

                     温度改变                            保留因子（k），柱效变化很小

柱平衡慢                         重新平衡时间不够             保留因子（k），柱效变化很小

柱超载                             样品量太大                         保留因子（k），柱效（N）


2.造成色谱峰（不对称）拖尾的原因



1.色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；

2.柱头有污染；

3样品超载；

4样品溶剂不合适；

5.柱外效应；

6化学或二次保留（硅羟基）效应；

7缓冲容量不足或不合适；

8重金属污染。



3.如何解决峰形拖尾的问题



A．与化学有关的拖尾问题

1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未

知化合物加醋酸三乙胺；

2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3．降低进样量至《1ug。



B．与色谱柱有关的拖尾问题

1．如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲

醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。

2．使用保护柱



C．与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽

1．进样体积过大，（通常≤25uL）；

2．进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应《20cm，内径为0.007″）；

3．检测器流通池的体积过大。





4．如何储存色谱柱



1．防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。

2．尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。

3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。

4．避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。

5．将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。

如何选择保护柱

    怎样选择保护柱，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料就越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手上紧即可。另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。

对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能的选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。