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标题:[求助]微血管内皮细胞培养方法

黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]微血管内皮细胞培养方法


因实验需要兔微血管内皮细胞，向各位请教微血管内皮细胞培养方法：

包括 培养基的选择、培养液中添加成分、原代及传代培养步骤。

初学阶段，多多指教！
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ALALA[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们隔壁实验室处理过一次，步骤如下：取体质量60 - 70g雄性SD 大鼠 无菌条件下取出大脑, 放入预冷DHank′s 中, 剥离软脑膜、大血管及大脑髓质, 收集大脑皮质, 剪碎成1mm3 的小块, 移入匀浆器中匀浆, 将匀浆液依次通过80 目和200 目尼龙网过滤, 收集200 目尼龙网上的微血管段。用0.12 %胶原酶37 ℃消化20min。冲洗液冲洗2遍, 离心所得沉淀用配制的内皮细胞完全培养液悬浮后,接种于明胶预先包被的培养瓶中, 37 ℃, 5 %CO2 培养箱中静置培养。约6 - 7 天细胞基本融合成片后, 用01125 %胰蛋白酶+ 0102 %EDTA 消化, 进行传代。
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢！请问你们用的是什么培养基呢，还有如何收集200

目尼龙网上的微血管段（留在网上的都是吗）？
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ALALA[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 黄花菜 的帖子

今天问了一下楼上的实验室，他们用的就是DMEM培养液，说留在网上的都是微血管段，具体的如何收集我也不太清楚啊！
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okhaha[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们是做乳鼠心肌细胞的微血管内皮细胞，方法跟群友的不是太像。选用DMEM高糖培养基。
1.取5-7天大鼠心脏，用PBS洗净血液
2.用75%乙醇浸泡30s
3.用PBS冲洗后，剪碎，用适量0.5%胶原酶在37度摇摆水浴中消化30min，加入适量0.02%胰蛋白酶，用吸管轻轻吹打，37度水浴中消化30min。
4.分离下的细胞过200目筛网，过滤液用20%小牛血清DMEM培养基混悬离心（1000转/min，5min），未过网的弃之。
5.所得细胞悬于20%小牛血清DMEM培养基，并调整细胞浓度到104-105/ml，接种于0.2%明胶预处理的培养瓶中37度培养4小时，以去除未黏附细胞，更换含50mg/L肝素、10mg/L内皮细胞生长因子的DMEM完全培养基培养。
6.每3-4天换液一次，直至长成细胞单层，选3-4代传代内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。
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dog002[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我个人比较赞同chengph的培养方法!
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
培养液多用DMEM，其中添加肝素、内皮细胞生长因子（VEGF或bFGF），培养底物要铺明胶或纤维连接蛋白。原代消化多用2型胶原酶
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问大家有取肾皮质培养微血管内皮细胞的吗？

还有如果是一次性培养瓶也要铺明胶？
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cocacola[使用道具]
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发表于 2012-6-8 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内皮细胞都要铺明胶预处理促进其贴壁的，并不是因为其是不是一次性用品。促进其贴壁的原因之一，防止在4h后吸出未贴壁细胞后，浪费太多有用的内皮细胞。再者更容易使内皮细胞贴壁生长。
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黄花菜[使用道具]
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 小中大
请问你现在还在培养这种细胞吗？
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