液相色谱

各位老师前辈，最近我在做一个复方丹参片的含量测定试验，检测方法是高效液相色谱法，方法是按照药典上做的，试验一开始挺好的都很顺利，可是慢慢柱压一点点升高最开始是16四天后就接近18了。我的流动相是甲醇：水75：25。
后来想长时间冲柱子可能会解决这问题，就用纯甲醇冲了7、8个小时冲柱的时候柱压在9左右，感觉还是很高就用乙腈和水梯度冲：先100%乙腈；然后乙腈水 50：50：最后乙腈水30：70.冲完之后压力降回来了，用甲醇水75：25压力是14（比最开始低2）。可是，这时色谱峰出现明显拖尾，峰型也变得矮胖许多。
我现在很着急，还有9天就要交论文了，恳切希望各位老师的帮忙

补充下，我测定的成分是丹参酮2a，谢谢

柱子使用频率高，之前冲的又不干净，导致柱效下降了，先用乙腈好好冲冲吧，如果冲完走样品还不行的话，考虑柱子再生。

从你描述的现象看，是色谱柱柱效不好了。
原因可能是：色谱柱塌陷了。
解决办法：填补色谱柱（估计很难达到理想效果），从新买新色谱柱。

高效液相色谱常见故障的断定及解决
可能的原因及解决方法
     (一)保留时间变化
         1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
         2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
         3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
         4.柱污染 每天冲洗柱
         5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
         6.柱快达到寿命 采用保护柱
     (二)保留时间缩短
        1.流速增加 检查泵,重新设定流速
        2.样品超载 降低样品量
        3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
        4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
        5.温度增加 柱恒温
      (三)保留时间延长
        1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
        2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
        3.键合相流失 同前(二)3
        4.流动相组成变化 同前(二)4
       5.温度降低 同前(二)5
     (四) 出现肩峰或分*
        1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
        2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
        3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
        4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
        5.进样器损坏 更换进样器转子
     (五)鬼峰
        1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
        2.样品中未知物 处理样品
        3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
        4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
        5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
     (六) 基线噪声
        1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
        2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
        3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
        4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
        5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
     (七)峰拖尾
        1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
        2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
        3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
        4.同前(四)4 同前(四)4
        5.同前(四)3 5.同前(四)3
        6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
        7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
      (八)峰展宽
        1.进样体积过大 同(四)1
        2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
        3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
        4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
        5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
        6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
        7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
        8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小
        9.样品过载 进小浓度小体积样品

一般呢用甲醇冲洗是因为它比较便宜（相对于ACN），当然新柱都是用ACN保存的，工程师也会推荐你使用ACN冲洗，反正是你花钱，对柱子也比较好，ACN的冲洗效果也确实比MECN要好。
发现你的冲柱设置的有点不合理。你的系统里水溶性杂质比较少且没有缓冲盐你都可以直接用纯甲醇冲洗，或者先用水/甲醇然后再用纯甲醇冲洗呢，你刚好相反，为什么呢？又或者如果有水溶性的蛋白之类的杂质或者缓冲盐你直接用纯甲醇来一下，柱子或者管路是很容易柱的，说到管路突然想到你顺便看看到底是柱子者还是管路者，引起柱压升高，再排查一下。
推荐一个冲柱程序给你试一下：）
程师介绍用这种方式冲柱活化，
用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱(分析柱)
不含缓冲盐的流动相
100%甲醇
100%乙腈
75%乙腈+25%异丙醇
100%异丙醇 (如果效果不明显，再考虑尝试以下步骤)
100%二氯甲烷 *
100%己烷*
*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, 则在重新使用反相
流动相以前, 必须用异丙醇冲洗色谱柱 !!!
By the way,压力总得带个单位吧，谢谢啦。

太感谢！楼上几位大侠了！

楼主可以试试加入三乙胺或者醋酸及醋酸缓冲盐来解决拖尾的问题，很有效的。

三乙胺针对硅胶羟基水解吸附碱性物质的拖尾有效；醋酸及醋酸缓冲盐对酸性物质的拖尾有效。离子浓度不要超过50mmol。

最好用甲醇做有机相，因为缓冲盐在甲醇-水中的溶解度均显著大于乙腈-水和四氢呋喃-水系统。

事后记得长时间冲柱子。祝楼主试验顺利！