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标题:[求助]用流式细胞仪器检测F-actin的变化，阴性对照...

羊咩咩[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]用流式细胞仪器检测F-actin的变化，阴性对照...


用流式细胞仪器检测F-actin的变化，阴性对照的荧光值总是比阳性高，但是整体趋势还对。别人做过同样的实验，我是完全按照他们的方法做的。 不知道为什么？各位高手帮忙分析分析。
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实验卡住了。各位有何高见啊？ 很着急啊。实验步骤：
收集细胞（1000rpm），实验组加入抑制剂冰上作用20min，再加入抗体冰上作用20min；或 加入等量DMSO（抑制剂是用DMSO溶解的）再加入抗体冰上作用20min；对照组什么都不加或者加入同型的IgG，在冰上放置同样的时间(40min)之后，实验组合对照组都放到37度作用10min,使F-actin发生聚合。加入pbs洗涤抗体1000rpm离心后，用4%的多聚甲醛室温固定20min，pbs洗2次后0.2%的Triton-x 100透化10-15min，pbs洗2次后，用FITC-鬼笔环肽室温作用30min,加入PBS冰上放置30min，1500rpm离心。重悬后一个多小时后或者次日检测。标记后的样品用锡箔纸包被了。有人建议将对照组先固定，不要再冰上等太长时间，我觉得那样就不是对照了。不知道各位有何高见?谢谢！！
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TAT[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你对照组也加DMSO,量与实验组一样.
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道楼主究竟哪个抗体才是流式抗体？
不知道你为什么在加第一个抗体之前不进行洗涤？
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为没作过你的实验，所以有些小问题还是请教一下楼主：
1. 你的所谓"阳性对照"是指哪一组?"阴性对照组"是不加任何处理因素的吗?你的抑制剂是抑制F-actin的表达吗?"阳性"的真正所指是出现了某种已经被明确肯定存在的效应，而并不是一定要在某项具体检测值上较“阴性”组的结果高。
2. 当前实验结果中F-actin的检测结果差异不外乎受两方面因素的影响,一是细胞本身表达量的差异及有效的细胞检测数目;再就是实验检测方法的稳定性和灵敏性的影响.不知楼主是怎样对照这些因素找原因的?
个人愚见，欢迎大家讨论!
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想提几个问题
1.楼主用的细胞是不是有自发荧光
2.最后上流式不是立即上最好吗？为啥要等一个小时后或者次日，这样荧光 不是可能会被萃灭吗
3.楼主说的阴性对照的阳性率有多高，是对照真的带荧光，还是为了照顾阳性组将“门”设置的位置不对
4.楼主是不是确定阳性组抗体确实标记上了，建议下次将上机剩下的细胞做成涂片在荧光显微镜下看看。
最后预祝下次成功！
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-6-15 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充几点，仅供参考：
（1）建议你首先检查机器：通常使用机器配套的标准小球进行测验（如同天平的调平）；
（2）你检测的抗体是否失效，此点也值得考虑？
（3）虽然步骤和别人相同，但你的操作怎样？
（4）机器的操作者技术如何，比如补偿之类参数的调节，也会影响你的结果？
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