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标题:[求助]PBMC分离出问题了，请帮忙分析下原因

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]PBMC分离出问题了，请帮忙分析下原因


我使用的是普飞的Cedarlane淋巴细胞分离液，操作也是按说明书进行的
1. 新鲜全血用PBS稀释
2. 稀释血按2：1加在淋巴细胞分析液页面上面，800×g离心20min，
3. 取中间白膜层，用PBS或培养基稀释，800×g离心10min，弃上清
4. PBS洗涤沉淀2次
5. 1640悬浮细胞，培养

我分离了3次，每次800×g离心20min后白膜也还是教清晰的，白膜吸取的也还算干净的，就是吸取白膜用PBS稀释后800×g离心10min后，就发现沉淀里有块状沉淀，移液管吹打也吹不散，淋巴细胞数量也很少，想请教下，这块状沉淀是什么东西，淋巴细胞数量少可能是什么原因引起的？
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有遇到块状沉淀，不知道怎么回事，能否介绍详细些
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

步骤3离心后的沉淀中，有部分沉淀是是结成块状的，白色，较薄，吹打不散，显微镜下观看吹打后较大的碎片上面看起来全是黑色的点，较小的碎片边上有时还能看到几个细胞，而且每次出现块状沉淀后最后得到的淋巴细胞的量也很少。
吸取的是白膜呀，都是细胞，怎么离心后会形成块状物呢？是离心使细胞碎裂形成的吗？另外我用的是EDTA抗凝管，会有影响吗？
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skytree[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的离心速度太高，时间太长，把细胞都离心死了。说一下我的方法，仅供参考：

步骤3、4：取得PBMC后用PBS洗涤，我只用1500RPM（485×g)离心6-7分钟，有的时候只用5分钟就足够了，或1070RPM（250×g)离心10分钟，像你那样，细胞不死才怪。

我一天要做10几个肿瘤病人和normal human donor的PBMC，用的是Leucosep系列的管子，中间带滤网的,用Ficoll-Paque Plus进行分离，可能第二步不一样，其他基本都应该一样的，尤其是提取PBMC后用PBS洗涤、离心的步骤。

重新试一试吧，希望你成功。

多交流
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天照你的建议用1000rpm离心10分钟，没再出现块状沉淀，细胞数量也还算多的。谢谢你。
另外再向你请教个问题，我的PBMC分离后第二天，细胞还都是单个的，没出现T细胞聚成细胞团的现象。我看到有人说培养的PBMC的状况是好是坏可以从T细胞团的数量上看出。我的PBMC没出现T细胞团会是什么原因？我的培养液中IL－2浓度为200U/ml。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果细胞少的话，你可以试一下1500rpm离心5分钟。
我这边培养液中IL－2浓度为100CU/ml，我不知道CU和U之间的换算关系，好象是1：6，我不敢肯定，你查阅一下。
T细胞团的数量上可以看出培养的情况
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

平时有时间，你可以在多个速度(1100\1200\1300\1400\1500\1600\1700\1800\1900rpm)同一个时间段(6')或者多个时间段（5‘、6‘、7’、8‘、9’、10’）同一个速度（1500rpm)进行比较，找出最适合自己的速度，因为仪器设备不同，会有一些差异的。

细胞培养有很多因素可以影响，你可以一步一步排除。培养好的话可以看到大量的细胞团。不过T细胞确实不好培养，必须小心翼翼，勤观察，勤换液（勤加营养素）……，终究是比较折磨人的。
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nn255[使用道具]
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发表于 2012-6-15 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PBMC分离貌似简单，但离心速度很重要很重要！为此，我痛恨我们细胞房里那台有着悠久历史（30Y）的破离心机，速度是狂不准，我是被害惨了！哎，往事不堪回首啊！
我也是用的 Cedarlane的lympholyte-H，还不错的。
“3. 取中间白膜层，用PBS或培养基稀释，800×g离心10min”，这一步，PBS加了后要混得很匀，用吸管猛吹打几下。
“T细胞团”我分离后基本上也是单个的呀，我想，是不是加了一些T细胞刺激剂才会成团啊，否则为什么啊。
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yueban-1147[使用道具]
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 小中大
这回分离得到的细胞数量还是可以的，就是培养过程中始终没看到T细胞团。培养的好的话即使只添加IL－2也应该出现T细胞团的吧？
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yueban-1147[使用道具]
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 小中大
我用Cedarlane的淋巴细胞分离液，步骤2分离效果还是挺好的，就是步骤3照说明书说的800×g离心10min后细胞都碎掉了出现块状沉淀，最后得到的细胞少的可怜，后来照lywsjlg的1000rpm 10min就没再出现这个问题。
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