[求助]请教小鼠骨髓提取树突状细胞的方法

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标题:[求助]请教小鼠骨髓提取树突状细胞的方法

ququer787[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是用的C57小鼠，无菌分离股骨和肱骨，冲出骨髓细胞，红细胞裂解液裂解红细胞后，离心，1640重悬，2小时后，去上清，加细胞因子（GM-CSF和IL-4），可是我发现2小时的贴壁细胞很少，之后根本形不成集落。我是一只小鼠种的一瓶，是不是要2只种一瓶呢，还有我加了裂解液后，室温放8分钟直接就离心了，也没加什么终止液，这有影响吗。终止液是什么呢，文献上说的也不清楚。
问题出在哪里呢，请各位前辈指教。

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、裂解红细胞离心后，弃上清，直接加rmGM-CSF和IL-4培养。“红细胞裂解液裂解红细胞后，离心，1640重悬”。离心后又“重悬”不是白离心了吗？为什么在2小时后加细胞因子？依据？
2、为什么要裂解8分钟？1分钟足矣。否则，对细胞伤害很大。
3、DC培养过程中。rmGM-CSF很关键，许多情况下是rmGM-CSF的活性不好。另外，GM-CSF是种族特异性很严格的。不能混用，我处有上好的rmGM-CSF ，如有兴趣可免费提供一点试用。
祝实验顺利！

summerxx[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人认为你的问题有几个
一: 同楼上的所说,你用红细胞裂解液裂解细胞2小时太长了，对细胞有损伤的，我们一般都用2分钟左右
二: 步骤是红细胞裂解后，用1640洗2遍,然后加含有GM-CSF和IL-4的细胞培养液来培养分化DC
三: 一只小鼠就可以了，不能混放,2只在一起会有影响的，细胞有特异性的,个体之间还是有差异
四:红细胞裂解液,好像没有中止液,只要离心把他去掉就可以,
五: 贴避时间至少一天把，开始贴比的都是巨噬细胞,一般第二天可以看到很多贴比的,而DC的
集落也一般二日之后才产生

ququer787[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我买的细胞裂解液说明书上说要10分钟，我看有文献说裂解后的细胞不加细胞因子培养2小时后，去掉未贴壁细胞，再加因子，对吗，可我还听说小鼠的细胞贴壁能力很差，2个小时只能贴很少啊。

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、红细胞裂解液也买现成的，说明你太有钱了，我用自己配置Tris-NH4Cl只要1分钟就够了，也许是你细胞裂解液太“高级”了，据我所知一种能裂解所有细胞的商品化的裂解液是需要10分钟的，如果确实是这种裂解液，那当然养不出细胞，除非你买的裂解液是次品。建议：仔细看说明书。
2、我的硕士课题就是关小鼠DC的，养了2年半的DC，看的文献不下100篇（决不吹牛），就是没看到2小时后再加细胞因子的，就我所看的文献，早期DC贴壁能力是很强的，而淋巴细胞是悬浮的，DC与杂细胞的分离正是利用这一特性而设计的。你如果有早期DC贴壁能力弱的文献不妨发到我的邮箱，奇文共赏。
3、2小时内DC的前体细胞是否能贴壁我自己试验过，也未查过文献，不敢评论。但你在2小时就去除悬浮细胞，则可能刚好去除了DC的前体细胞，当然养不出DC，除非你想养巨噬细胞。
4、细胞是否贴壁与种族无关，而与细胞类型有关。我从未听说小鼠细胞难贴壁。建议多看文献，多思考。

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-6-15 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发一张DC照片，以供参考。（顺便说明：rmGM-CSF是自己表达的）