[求助]MTT药物干预实验疑难问题

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标题:[求助]MTT药物干预实验疑难问题

知了知了[使用道具]
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发表于 2012-6-15 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友:
我在做中药抑制肿瘤细胞实验,做了三个多月,到现在有个问题得不到解决,甚是失落,只好请教各位志士.
开始我以参考文献中的中药浓度做体外干预肾癌细胞,
第一天, 细胞完好,外观加药培养基清亮;
第二天, 瓶底就出现大量渣滓,好似泥沙一样,
第三天, 一层膜状物铺满瓶底,填塞细胞之间,加药培养基混浊,隐约可见少量完整细胞,
第四天, 外观液体混浊,镜下大量片状物飘浮,
同学说这是污染,我就重新配制药液(高压消毒后,3000g离心),加进新鲜培养基,结果仍出现上述问题,是药渣?过滤器过滤后,排除污染和药渣,但仍出现该问题,又咨询了相关人士,可能是药物浓度太大问题,于是我就降低浓度做梯度浓度实验,在降低10倍时没出现.
再者,在原浓度做MTT实验时,第一天除了结果稍有误差外,没有问题,但第二天除了出现泥沙样杂质外,加MTT后变紫黑色,污染现象.
问题1:若是污染,为什么降低浓度就不出现?
问题2:若是浓度太大,应该是细胞凋亡或死亡,不能还原MTT,最终颜色变浅,为什么反而变深

tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-6-15 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问用的是单味中药，还是汤药？如是单味中药，溶剂是什么？是否做了溶剂的对照？
关于MTT，加MTT变成紫黑色，可能是MTT同混浊的培液反应所致，不代表活细胞摄入的MTT多，最终看DMSO溶解后的检测结果是否较高。
遇到这种情况，培液、药物及溶剂三者均需考虑，不像是污染。供参考，希望早日解决！

知了知了[使用道具]
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发表于 2012-6-15 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢楼上战友
我用的是复方中药紫龙金,干粉状,深褐色,4℃密封保存.配制时用双蒸水溶解,并高压灭菌促溶,3000g离心后取上清,再加等量过滤好的2×1640培养基,加胎牛血清含量10％.
MTT实验时加MTT颜色深的组检测结果达到2.0~3.0.阴性对照在0.5~0.7.

tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-6-15 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

共同交流和学习^_^
有以下方面的考虑：
1. 该复方中药成分可能比较复杂，“双蒸水溶解,高压灭菌促溶,3000g离心后取上清”是该药的经典用法或文献约定俗成的用法吗？一般认为，配制药物，对不易溶于水的，可选有机溶剂如DMSO。消毒采用过虑法（高温高压可能损害药效，尤其是含蛋白成分），3000g离心后是否会将药物有效成分沉淀掉（不大了解中药，只是假想，见笑了）。
2. “参考文献中的中药浓度”，也是用双蒸水配制然后高压灭菌的吗？
3. MTT颜色深似乎找到了答案：一种可能是提取的该药上清含较多的褐色色素，黏附于皿底，出现假阳性；另一种可能是该色素成分可进入细胞（及死细胞）。是否可以设立0以下几组进行排查：单纯中药；中药+培养液；中药+培养液+细胞；培养液+细胞；阴性对照。最后弱弱的问一句：MTT是按正常程序做的吧？

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-6-15 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我个人有以下几点考虑，跟你探讨一下。
1.OD值这么高很有可能是污染了；但你说药是深褐色的，它溶解完还是有颜色的吗，OD值测得就是它颜色之间的变化，会不会是你药物的颜色干扰了呢。
2.如果药物是水溶性的，那为什么不直接用培养基溶呢，双蒸水毕竟不是等渗的，直接加到细胞里对它生长不好的。
3.最好还是过滤除菌吧，高压后可能药物会有一定的变性，而且高压只是灭菌，但菌还是存在的，而且灭菌前所分泌的那些代谢产物也是除不去的，感觉对细胞不好。
4.这点你已经想到了，但还是提醒一下吧，做个浓度梯度，切不可浓度太高。还有你的中药是药材提取物吗，还是单体的配伍阿，如果是前者可能会有效成分含量太低，而杂质含量高，这样的结果也不可信吧。
呵呵，新手，仅供参考！

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-6-15 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近用96孔板做浓度梯度实验,又在第三天时每组选一孔加10μlMTT,4小时后拍照.拍照的分阴性对照组,30μg组,40μg组,50μg组,100μg组,300μg组,500μg组,1000μg组,