小中大[求助]原代细胞培养失败与培养基配制
我是养细胞的新手，现在正在做原代细胞的分离培养。所养细胞用的是Gibco的高糖DMEM干粉，按说明书应该添加碳酸氢钠3.7g/L。另外查阅文献所养细胞对PH的要求比较苛刻为7.2～7.4，所以参考文献介绍准备添加20mM hepes，但考虑到添加hepes可能会影响培养基的渗透压，所以很犹豫，不知该不该添加，添加了hepes后碳酸氢钠的量要不要改变？后来根据文献介绍（但文献中用的是Hyclone的DMEM）只添加了1.97g/L的碳酸氢钠，同时添加20m Mhepes，配制好后用10MNaOH调PH到7.2～7.4（过滤后测PH不超过7.5）。而且我在配制培养基时没有考虑到血清与培养基是等渗的问题，5％的血清体积是算在需要溶解DMEM干粉所需液体之内的（如取水950mL溶解1包干粉，再加50mL血清）。另外还添加了一些其他的因子，但做了几次，所养的细胞初期可以帖壁，生长也还可以，但都不等细胞铺满，在16天左右开始死亡。
近期正在寻找失败的原因，请问各位高手我培养失败与我所配制的培养基有哪些直接的关系，我应该怎样做来避免这些问题。如果有配制培养基时加血清没有考虑等渗的问题，现在我手头这样配制的培养基还有500mL，应该怎样补救，不用太可惜了！如果是碳酸氢钠和hepes添加不当的问题，应该如何添加？碳酸氢钠和hepes的添加之间有什么关联？恳请赐教。
另外还有一问题请教各位高手，谷氨酰氨添加过量对细胞有没有毒性。我们实验室的干粉培养基一次不是配制一个最小包装（1L），而是以200mL、400mL等这样的量来配制，剩余的干粉封口后仍于4度保存，但有时可能封口不严，再次用时干粉有些潮解结块，这对其中的营养成分可能会有影响，尤其是谷氨酰氨可能降解，用这样已经结块的干粉配置培养基时，想重新再添加谷氨酰氨，又担心会过量，请各位给出出主意。
