小中大四 传代培养
待细胞生长成单层后，弃培养液，PBS洗两次。0.01%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，按1：3-1：5传代
五 血管内皮细胞鉴定.
1. 用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞, 接种在24 孔塑料培养板各孔内4 h 后, 大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状, 少数细胞伸展, 48～ 72 h 生长最快, 逐渐生长成梭形, 有些细胞排列呈鱼贯状相连, 间有旋祸状排列。核清晰, 呈圆形或椭圆形, 核分裂相多见, 1～ 2 核仁, 胞浆丰富, 内含小颗粒。于3～ 4 d 后融合, 7～ 10 d 胞体呈多角形,相互嵌合, 为单层呈铺路石状排列。
2. VⅢ F相关抗原免疫光法检测：
2.1 操作：培养三天至四个星期内，在24 孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5 cm ×0.6 cm ,在盖玻片上点100μl 浓度为5. 0 ×105 / ml 的细胞悬液, 在37 ℃,5 %CO2 条件下培养4 h , 使细胞贴壁, 然后加入2ml 培养基继续培养。待内皮细胞生长至近融合状态
时,用PBS 洗3 次,每次5 min ,然后加入丙酮,室温下固定10 min ,再用PBS 洗3 次,每次5 min ,干燥后加第一抗体———兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体100μl(1 : 50 倍稀释) , 放入湿盒内37 ℃保温1 h , 同时以磷酸缓冲液替代一抗作阴性对照。用PBS 洗3 次,干燥后加FITC 标记的二抗———羊抗兔IgG , 放入湿盒内37 ℃保温1 h , 用PBS 洗2 次, 再用蒸馏水洗一次, 干燥后用50 %缓冲甘油封片。然后立即在荧光显微镜下观察, 摄片。
2.2 理想结果 原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色, 胞核呈黑绿色, 整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中, 偶见绿色斑点散发荧光, 未见细胞轮廓。
然后用rhTNFα造成细胞损伤及凋亡，并用药物干预
有那些需要改正，请赐教！
