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标题:[求助]请教HL-60细胞的复苏及培养,谢谢!

superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教HL-60细胞的复苏及培养,谢谢!


俺是新手,HL-60细胞复苏后大部分死了,不知道是什么原因,打算重新复苏.
请教各位:HL-60细胞复苏时有什么特别技巧没有(以前看到过HL-60细胞复苏时要将瓶盖拧紧一天,不知道是复苏后拧紧培养瓶盖放进培养箱一天,还是别的什么意思)?需要注意什么?最适培养条件是什么?怎么换液?
还有怎么知道HL-60是不是分化了?分化成什么了?
期待养过此细胞或者正在养的高手们不吝赐教,先谢过了
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

后天就要复苏细胞了,可是还是有细节不是很熟悉,HL-60细胞培养液中要不要加双抗呢?血清加百分之几好呢?复苏后马上离心好还是第二天再离心好呢?焦急等待中,请各位指导指导哦
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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养过很长一段时间的HL-60，这个细胞给我的感觉就是没养顺时不知为啥很容易死亡，养顺了，呵呵，怎么折腾都死不了，很有意思。
你复苏的时候可以照我以下建议的试试，我都是这样复苏的，不过前提是上次是在细胞状态很好冻存的。
我的复苏步骤是：迅速取出冻存管，在37度水浴振荡快速融化，加10倍体积新鲜培养液，然后800转离心5min，弃上清时稍稍留些液体，加少许培养液，轻轻吹散细胞，然后转瓶，补充培养液。补充的培养液可将血清加至20%，不过这也不是完全必要，只是为了最大程度的保证你复苏的细胞更好的恢复。后来养得顺了，我甚至都不离心直接轻轻吹散后转入培养瓶，但一定要加够体积培养液。
第二天观察细胞，如果细胞活的不多，倒也不着急换液，可再等上几天再小心离心换液。总而言之，不要着急丢弃你的细胞，状态不好就放在那里，过几天观察一下，悬浮细胞很容易自己恢复过来的。
至于细胞分化的问题，是不是分化了我也不是很有经验，我只知道如果养个半年以上至少做流式时能感觉到。所以复苏了细胞，首要的是不着急展开试验，而是要大量的扩增培养，然后狠冻它几管，三个月复苏一只新的。
OK，就这些了！
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢！我会按你的建议试试看的，复苏完了再向你汇报汇报，顺便再请教请教．
还有你还没告诉我要不要加双抗呢，因为我从别人那里要回来的这种细胞过了一周多发现污染了，也丢弃了，给我细胞的师兄加了双抗，我师姐说不用加，我没加后来发现污染了，请再指教指教，多谢哦～
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是加双抗的。除了血清增加外，其它与平常的培养液没什么区别，该加的我都加。
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我今天重新配的培养液复苏的细胞，加了２０％的血清，也加了双抗，看看明天细胞怎么样．
对了，再请教楼上,刚开始是不是要每天换液呢，每次换液都要离心么?
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养基是：DMEM+20%胎牛血清
刚开始的时候，不要勤换培养基。
等细胞长起来再换培养基。每次换液都要离心。
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那再请教一下,我怎么知道细胞该换液了,培养液变成什么颜色就应该换了呢?谢谢
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vcve[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你看到细胞太密了，培养基变黄了，就该换液了啊。长的好的时候最好天天换。个人经验。
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-6-16 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的帮忙,我昨天复苏的细胞今天观察状态非常不好,复苏了两支,其中一瓶细胞有点密,但是碎片非常多,另一瓶细胞很少,但是好像活的比例大一些,今天没有换液,因为长得不满,培养液颜色也还稍微有些红,明天再观察看看吧,希望会长起来,再次谢谢大家哦~
对了,大家们在换瓶的时候有没有计数呢?是不是要经常用台盼蓝染色看看细胞活力呢?
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