小中大[分享帖]新手膀胱平滑肌细胞培养两个月总结暨求助
自4月份末开始第一次进行膀胱平滑肌细胞培养，先后养过人的，大鼠的，猪的，采用胰蛋白酶和I型胶原酶消化法。
今天刚将细胞爬片送去做了免疫细胞化学，结果不是很好，很受打击阿。
现总结一下这两个月，并诚心请教一下同行。还请指正，也欢迎养平滑肌细胞的战友相互交流学习。
膀胱平滑肌细胞培养，常用的有组织块法（我没有试过），组织块法较省钱吧，但是据说细胞爬出比较慢，且成纤维细胞较多。消化法我利用胰蛋白酶（Gibco）和胶原酶（Sigma）。做人膀胱平滑肌细胞的时候：胰蛋白酶消化大约30m，胶原酶消化时间我试过30min～90min，均在37°培养箱中进行，不时振荡。
1.消化时间：原代培养一般种植一瓶，刚开始的时候为了尽量将组织消化彻底，胶原酶消化时间较长，细胞接种后生长很缓慢，大约要两周才能传代，而且传代后细胞仍生长缓慢。这也是在我后来缩短胶原酶消化时间到30min，发现接种后细胞生长状况很好，约7天就可以传代。
2.千万要无菌操作，我有血的教训阿。第二个月的时候，一次既做原代，又做传代。第二天去一看，除了还剩两瓶人的细胞外，其余的细胞全部污染了。因为人的标本在临床很难搞到，而这次污染把两个人的标本都污染了，损失惨重阿。间接的后果就是每次我换液或者传代后的那个晚上都比较忐忑，都一直在牵挂着细胞是否会被污染••••
3.实验设计欠周详：我们科以前没有细胞培养的基础，也就只有我一个人做细胞培养。很多时候遇到了问题找不到人请教，自己在论坛和书本上也只是学习，遇到了很多实际的细节的问题还是很麻烦。所以我的实验是在摸索中度过的，一边做，一边进一步完善思路。所以这就导致了我有时候都不知道到底会走到何方。直接的后果就是试剂耗材的订购所花的周期太长。要花很多时间在等待试剂上面。
4.今日免疫细胞化学，一张片子上仅能染出几个细胞SMA阳性，Desmin阳性细胞更少。而阴性对照组我后来进行HE染色后可见大量细胞。不知道是怎么回事？我细胞爬片用4°丙酮固定10min，用的一抗是病理科的即用型的一抗（37°4h），二抗（37°40min）
免疫细胞化学－SMA
