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标题:[求助]差速贴壁纯化心肌细胞不贴壁

biabiade[使用道具]
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发表于 2012-6-16 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]差速贴壁纯化心肌细胞不贴壁



细胞用胶原酶消化5h接种玻璃培养瓶，1.5h后吸出细胞液至另一培养瓶培养以去除成纤维细胞，原瓶内成纤维细胞加培养液继续培养，24h观察，发现转瓶后心肌细胞未贴壁，培养液中为大量细胞碎片状东西以及未贴壁的细胞悬浮，仅见极少量的成纤维细胞贴壁生长，接种24孔板也是这样（24孔板为新，非重复使用），接连几次都是这样，很是郁闷。而原瓶内分离的成纤维细胞生长良好，且可见少量心肌细胞贴壁成团生长，有搏动，真是太奇怪了。请心肌细胞培养的高手帮忙分析一下，可能是什么原因导致转瓶后细胞贴壁失败，急，先谢了！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-6-16 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个情况和我以前刚开始养心肌细胞的情况是相似的的,我当时找原因时的几点考虑希望可以帮到你:
1.尝试把胶原酶换成胰酶:我比较过单用胶原酶,胶原酶和胰酶合用,单用胰酶这三种情况下的心肌生长,发现单用胰酶的效果好,我使用的浓度是0.1%
2.细胞到底有没有消化下来?:
A.你是采用什么消化方法?是分次消化吗?如果是分次消化的话,回想一下你的心肌组织块在消化结束时候是全部都消化完了吗?还是只是变白,体积稍变小(如果是这种情况,那细胞没有消化下来的可能性比较大)?消化了几次?是不是每次消化都能看到消化液变浑浊?
B.在差速贴壁后,虽然当时可以在见到很多悬浮细胞,但可能这大多数都不是心肌细胞,而是其他的杂的细胞.
C.但是奇怪的是你说成纤维细胞生长良好,又不太可能是细胞没有消化下来,想请问你在差速贴壁后原瓶是不是已经看到原瓶中有很多细胞贴壁变形?如果是的话,那要重点考虑培养中的问题以及心肌细胞的活力问题了.(要注意的是,即使只有少数的变形,那在24小时后也是可以长的很好的,因为成纤维细胞很好长).
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biabiade[使用道具]
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发表于 2012-6-16 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
经过将近一个月的摸索，终于发现问题所在了！ 写出来跟大家共享。
转瓶后心肌细胞不是不贴壁，而是没有活细胞可以贴壁了！我尝试在不同时间转瓶，发现15min时就已经有很多心肌细胞贴壁了，而且是活力比较好的心肌细胞。我将原瓶继续培养，结果长出了不少心肌细胞，搏动也很好，正说明了这一点。文献上说的是1.5~2h转瓶，其实这时很多活力好的心肌细胞已经贴壁了，吸出来的上清只有细胞碎片和活力不太好的心肌细胞。所以我建议缩短转瓶时间，或者转瓶时将原瓶轻轻冲洗一下。
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ALALA[使用道具]
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发表于 2012-6-16 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了同样的问题，用的是0.125％胰酶冷消化过夜，之后再用0.125％胰酶消化两次，每次约8分钟，含10％胎牛血清DMEM终止消化，1000转，8分钟离心，差速贴壁90分钟，两天后发现心肌细胞基本不贴壁，成纤维细胞长得比较好，今天刚换了液，剩下的心肌细胞就那么一点点，还都是接近圆形的，不知道是什么问题：1.胰酶浓度过高？2.离心转速和时间太过？
还在养，不知道心肌细胞能不能活，希望能继续交流
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biabiade[使用道具]
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发表于 2012-6-16 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的情况的确跟我以前相似，建议你下次再取原代心肌时试试缩短差速贴壁的时间，看看心肌细胞是否贴壁多些，或者把原瓶加培养液培养，看是否有很多心肌细胞生长，这样就可以找到原因了。
我没有试过胰酶冷消化过夜，但个人认为可能对心肌细胞损害有点大。
我用的离心速度跟你一样，应该没什么问题。
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 小中大
原瓶里的细胞长得还可以，不知道如何区分原瓶里的心肌细胞和成纤维细胞啊，因为看文献都说是一到一个半小时贴壁。下次我试试缩短差速时间。
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biabiade[使用道具]
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发表于 2012-6-16 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

倒置显微镜下心肌细胞和成纤维细胞不太好区分，实在想证实可以做免疫组化，但是搏动的细胞肯定是心肌细胞。
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发表于 2012-6-16 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
又养了一次,十只乳鼠热消化十只冷消化,用的是0.08%的胰酶,差速45分钟,原瓶的成纤维细胞长得还可以,但转出来的心肌细胞就是不贴壁,换液后就剩下很少的贴壁心肌细胞.我没有用细胞计数板,但冷消化的那个皿心肌细胞密度让师兄看过,他说可以的,他是养心肌细胞的高手啊.
下次做时染色看看心肌细胞的活性,真的不知道问题出在哪里,都快没信心了!
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ALALA[使用道具]
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 小中大

第四次养。有很多心肌细胞搏动，感觉还可以。只是我十五只乳鼠才接种了一个60mm的皿，师兄说十只鼠就可以种三只60mm的皿了，组织消化四次就都消化完了，一点不剩啊，我接种前用滤布过滤了下应该影响也不是很大吧，为什么细胞这么少呢？不知道哪一步丢了细胞，会不会是离心时转速低了，细胞没下来呢，加含血清培养基终止后我用的是800转10分钟，然后PBS洗了再1000转8分钟，应该不小了吧？转速再我怕会损伤细胞。请教了！
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tianmei001[使用道具]
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 小中大

我的为什么都是圆的啊?死了?
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