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标题:[求助]请问如何获得处于细胞周期不同时相的细胞？

S6044[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请问如何获得处于细胞周期不同时相的细胞？


因为不是专门做细胞生物这一块的，所以想请问一下各位高人，如何获得处于细胞周期不同时相的细胞？包括G0、G1、S、G2、M等等，有什么好的文章推荐吗？另外，自己在网上查了，也看了一些国内的文章，看到的主要用的还是诱导同步化法（如：胸腺嘧啶双阻断法制备同步化细胞）。

有帖子中说：用这种药物诱导的方法所获得的同步化的细胞，其中的基因表达与自然情况下获得的相应时期的细胞内的基因表达并不相符（好像是PNAS中的一篇文章），这样的话，继续用这种方法来研究启不是没什么意义啦。高手能帮忙回复一下吗？谢谢啦
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有个问题，就是通过流式能够把自然生长的细胞当中不同时相的细胞分离开来吗？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

流式可以对一细胞群体进行细胞周期分析,分析各期的比例, 但不能把自然生长的细胞当中不同时相的细胞分离
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我来回答一下：

自然同步化主要有有丝分裂摇落法（可以得到少量M期细胞）

还有离心淘汰法（理论上能够得到G1,S,G2/M但是很难满足实验需要）

血清饥饿是一种比较好的方法，能够使大部分细胞处于G1期，我做过可以达到80％多，缺点是纯度不能达到100％

还有一种方法是在细胞培养到一定时间后，放入4度培养一定时间再用摇床摇可以获得较多M期细胞

关于药物同步化的方法推荐下面的药物，（其它药物如胸腺嘧啶、秋水仙素毒性太大）
mimosine － G1
Hoechst 33342 － G2/M
Aphidicoline － S

这几种药物你可以到NCBI查阅相关文献！

关于你提到的药物改变细胞某些基因表达不符我觉得这不是很重要，只要做好对照应该消除由药物带来的影响，不知道你做的那方面的实验。
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我想采用你说的药物同步法来进行研究的话，那么要得到G1,S,G2/M就要分别使用上述3种药物啦？
我想研究某些基因在不同细胞周期时相间的表达是否存在差别，那么对照应该如何选择，才能消除由药物带来的影响呢？直接用Realtime-PCR检测不同细胞周期时相间基因表达量，再进行比较不就可以了吗？那该如何选择对照呢，请指教？
是否需要以同步化前，第一时间的细胞作为对照呢？那每次同步化实验的细胞间也是存在差别的啊，可能各期细胞的组成并不相同啊?
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发表于 2012-6-20 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. nocodazole release-aquire M phase cell
2. double or single thymidine block- aquire S phase cell
3. serum starving- G1 phase cell.

other method like Hydorxyurea, or use chk1 inhibitors possible work.
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞周期同步化方法虽然可以获得相对较多的G1期细胞和S期细胞,但其细胞所处的状态不一.目前有较高级的流式细胞仪可以进行细胞周期分选,但不是每种流式都可以做的.我也曾想做这方面的研究,经查发现BD Aria流式细胞仪可以进行细胞周期分选,且配有进行活细胞分选的激光管.可惜本单位的一台最牛的机器有高人在招标时将能进行活细胞分选的激光管配件删除了,至今不能进行.而目前的机器只能进行固定的细胞分选,不能进行基因表达和蛋白质组方面的研究,实在遗憾!
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发表于 2012-6-20 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议阅读下面参考资料
Review Open Access
Microarray analysis of gene expression during the cell cycle
Stephen Cooper*1 and Kerby Shedden2
Address: 1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, Ann Arbor Michigan 48109-0620, USA and
2Department of Statistics, University of Michigan, Ann Arbor Michigan 48109-1092, USA
Email: Stephen Cooper* - cooper@umich.edu; Kerby Shedden - kshedden@umich.edu
* Corresponding author
Double thymidine blockAffymetrix, cell cycle, synchronization, nocodazole, yeast, HeLa
Abstract
Microarrays have been applied to the determination of genome-wide expression patterns during
the cell cycle of a number of different cells. Both eukaryotic and prokaryotic cells have been studied
using whole-culture and selective synchronization methods. The published microarray data on
yeast, mammalian, and bacterial cells have been uniformly interpreted as indicating that a large
number of genes are expressed in a cell-cycle-dependent manner. These conclusions are
reconsidered using explicit criteria for synchronization and precise criteria for identifying gene
expression patterns during the cell cycle. The conclusions regarding cell-cycle-dependent gene
expression based on microarray analysis are weakened by arguably problematic choices for
synchronization methodology (e.g., whole-culture methods that do not synchronize cells) and
questionable statistical rigor for identifying cell-cycle-dependent gene expression. Because of the
uncertainties in synchrony methodology, as well as uncertainties in microarray analysis, one should
be somewhat skeptical of claims that there are a large number of genes expressed in a cell-cycledependent
manner.
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yychen[使用道具]
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 小中大
如果我想采用你说的药物同步法来进行研究的话，那么要得到G1,S,G2/M就要分别使用上述3种药物啦？
我想研究某些基因在不同细胞周期时相间的表达是否存在差别，那么对照应该如何选择，才能消除由药物带来的影响呢？直接用Realtime-PCR检测不同细胞周期时相间基因表达量，再进行比较不就可以了吗？那该如何选择对照呢，请指教？
是否需要以同步化前，第一时间的细胞作为对照呢？那每次同步化实验的细胞间也是存在差别的啊，可能各期细胞的组成并不相同啊?

————————————————————————————————————————————————————————————————

您的这个实验思路不错，但是相当有难度。
2001年诺贝尔奖Tim Hunt利用海胆卵做材料，发现了Cyclin的周期性变化。建议你读一下相关文献看看他们是怎么做的。我认为他们获得诺贝尔奖是因为他们分别用了酵母、非洲爪蟾和海胆卵做材料。因为这些材料很容易获得处于相同细胞周期的细胞，然后根据周期各时相的时间就能算出细胞处于那个时期。

对于哺乳动物细胞，我有个想法供参考
先将细胞用血清饥饿法是它们停留在G1期，然后分别取4、8、12、16、24小时等时间段的细胞用PI染色测周期，这样您就能找到细胞周期各阶段所需时间。比如在12小时S期细胞达峰值、16小时G2期细胞达峰值等。然后你就可以用Western检测相关基因的表达情况。

这只是我个人的想法，其它战友也可以来讨论！最好还是看看Tim Hunt的文献！
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 小中大

你说的采用血清饥饿法使它们停留在G1期，然后分别取4、8、12、16、24小时等时间段的细胞用PI染色测周期，这样您就能找到细胞周期各阶段所需时间。但不知道通过这种连续的时间采集所获得细胞周期同步化的效率有多高，某个固定时相的细胞能达到80％吗？
呵呵，多谢你的回复！这样应该也是可行的，但是不同细胞还得进行相应的摸索。有空再看看Tim Hunt的文献啦。
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