[求助]免疫荧光

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标题:[求助]免疫荧光

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想做免疫荧光，不知道怎么选择二抗，请教一下大家。

glass[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一，与抗原相关
第二，与一抗相关

49888[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主最好是可以将你的实验的免役荧光部分的设计讲清楚，大家都可以帮你！只是现在能说的也就楼上的了。查了些资料，看有帮助没？！

用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应
　　用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。
　　1．免疫荧光技术　免疫荧光技术（immunofluorescence techni）是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。
　　（1）直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。
　　（2）间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体
　　免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素（FITC）发黄绿荧光，用罗丹明（TMRITC）发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。

skytree[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我搜索得到的一些内容，希望对你有所帮助！
免疫荧光细胞化学的原理
　免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量
　　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
　　免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。
　　一、直接法
　　1．检查抗原法这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
　　2．检查抗体法将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。
　　二、间接法
　　1．检查抗体法（夹心法）　此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
　 2．检查抗体法　用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
　 3．检查抗原法双薄片　　此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。

skytree[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三、补体法
　　 1．直接检查组织内免疫复合物法　用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物--- 抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。
　　2．间接检查组织内抗原法　常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。
　　四、双重免疫荧光标记法
　　在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
　　五、对照试验
　　为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验：
　　1．直接法　需设下述对照试验
　　（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。
　　（2）抑制试验：可分为二步法和一步法。
　　①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
　　②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。
　　（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光。
　　如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
　　2．间接法
　　（1）自发荧光对照：同上（一）。
　　（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
　　（3）抑制试验：同上。
　　（4）阳性对照：同上。
　　如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。
　　3．补体法
　　（1）自发荧光对照
　　（2）荧光抗体对照
　　（3）抑制试验
　　（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1：10稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
　　（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用1：10稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。
　　（6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位啦！
我要在同一细胞标本上同时检查两种抗原，这两种抗原都没有荧光抗体，是不是要用夹心法，先加入各自的特异性一抗，再加荧光二抗，那么这两个的荧光二抗怎么选择呢？

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发表于 2012-6-20 13:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

检2种抗原,加各自特异性抗体,需排除交叉反应性,再加相应的荧光二抗(要加以区分只需使用不同荧光标记的二抗,如:一个绿荧光,一个红荧光),这样就可以通过荧光的不同鉴定这2种不同抗原.
具体步骤可以参考相关文献,一般都是先加一种一抗,再加相应2抗,然后加另一种1抗,再加相应2抗.

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发表于 2012-6-20 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

排除交叉反应性
请教如何排除？可否介绍一些类似文献指导？
谢谢！

windy+++[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我意思是说2种抗原和它们的抗体之间没有交叉反应,用单抗当然最好拉,用多抗的时候,当两种抗原存在相同的抗原表位时才考虑,否则直接用就行.我是这个意思.sorry,没有讲清楚.

缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-6-20 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用带有不同荧光标记的能识别不同来源一抗的二抗，简单举例：一种一抗用鼠源的，另一种一抗用兔源的；二抗一种用FITC（绿色）标记的抗鼠的二抗，另一种用Rhodamine（红色）标记的抗兔的二抗。

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