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标题:[求助]G418筛选预实验

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发表于 2012-6-21 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]G418筛选预实验



刚刚接触细胞培养,要做稳定转染.看了些资料和帖子,有点晕!想跟大家请教一下.G418筛选预实验是用未转染的细胞做吗?选10-14天内细胞死亡的最小浓度.然后将更高一级别的浓度应用于转染的细胞.是这样吗?希望尽快得到您的指教!万分感谢!
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发表于 2012-6-21 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418筛选预实验是用未转染的细胞做,选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞.
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发表于 2012-6-21 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yes4 于 2012-6-21 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

G418筛选预实验是用未转染的细胞做,选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞.

看来我理解的还是正确的!
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发表于 2012-6-21 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

取细胞按一定密度接种于24孔板，待细胞生长状态恢复，且细胞密度小于满培养皿单层细胞数的50%时，弃去原培养液，加入含不同浓度G418（200-800μg/ml）的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，三天一换液，继续培养2周，观察细胞死亡情况，以高于杀死全部细胞的G418最小浓度的一个梯度为筛选浓度，以筛选浓度的一半为克隆细胞维持培养的浓度。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-6-21 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"G418筛选预实验是用未转染的细胞做吗?"

————————————————————————————————————————————————————————————————

看来小兄弟你对G418筛选体系还没有理解，G418是一种细胞毒性药物(氨基糖苷类抗生素)，依不同浓度，对细胞有一定的抑制或杀伤作用，而拟转染的质粒上带有G418的药代酶，能降解G418，从而使细胞获得对G418的耐药性。也就是说转染后的细胞可以耐受G418，而未转染成功的细胞不能耐受G418，因而被杀灭或抑制。通过G418筛选体系，使得未转染成功的细胞比例不断减少，转染成功的细胞比例不断增高。
如果G418浓度太高则会杀伤所有的细胞，如果G418浓度太低则没有什么毒性，两种情况都不能起到筛选作用。
G418筛选预实验则是先用未转染的细胞做，选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞；因为不同的细胞对G418的耐受性也不一样。这样的目的是找一个实验细胞能耐受G418的工作浓度，从而为筛选转染的细胞打下基础，因为这种浓度只能抑制未转染的细胞，而不抑制转染成功的细胞的！从而起到筛选作用。

建议你再多查找一下国内外相关文献，实验动手之前一定要明白其原理，要不然会很盲目！充分的准备可以避免走很多不必要的弯路！
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发表于 2012-6-21 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还想问一下,第二次筛选要怎么做?
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发表于 2012-6-21 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第二次筛选就是将转染好的细胞接种培养后，向培养液中加入G418以杀伤或抑制其中的未转染成功的细胞，因为不管转染效率多么高，都不可能是100%，所以要通过G418筛选体系（或者其他筛选体系）来筛掉那些没有成功转染的细胞，此时加入G418的浓度可以略高于你第一次预实验时摸索出来的“最小有效浓度”，实验中可以再根据细胞生长情况进行浓度的调整！
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发表于 2012-6-21 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418筛选实验比较麻烦,多花点时间吧
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发表于 2012-6-21 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢您的耐心指教!不过我问的第二次筛选是经过第一次筛选以后,已经筛选出一部分转染细胞了,但是因为有些细胞还是会丢失目的基因所以要得到稳定表达的细胞还要进行2-3次筛选!这时候还是用原来预实验的浓度吗?还是要再提高一个浓度?
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发表于 2012-6-21 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是你要在荧光显微镜下观察一下，判断一下细胞转染的效率，也就是转染成功的细胞的比例，再根据情况选用或高或低的浓度！转染成功的细胞的比例越高，则加入G418的浓度就可以越低。
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