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标题:[求助]脾脏制取淋巴细胞

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-6-24 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]脾脏制取淋巴细胞



小鼠脾脏制取淋巴细胞后，培养几小时却发现细胞都沉在底下，上清里基本没有细胞，到底是怎么回事啊?请各位指教
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发表于 2012-6-24 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就是这样的，细胞密度大啊，沉底
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发表于 2012-6-24 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢哦，我等了好久也没人回复，今天看到你的回复我非常开心。你在40倍镜下观察到的脾细胞是什么形状的啊？它贴壁了，你是怎么处理的啊？希望多指教，我最近一直为这个头痛，因为又做了一次效果还是不好。
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发表于 2012-6-24 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主具体是想解决什么问题不是很清楚，你是要用脾淋巴细胞做什么相关的实验？你取脾研磨后，是怎么分得淋巴细胞的？

培养的时候，由于细胞密度大是会沉底的，但T、B淋巴细胞是不贴壁生长的，在镜下看应该是呈圆形的，用枪轻轻吹打就能悬浮起来，但如果混杂了单核细胞的话，这类细胞是贴壁生长的，在活化状态下，贴壁生长的单核细胞能伸出角变长，变大。
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发表于 2012-6-24 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做多糖抗肿瘤实验的，通过对荷瘤小鼠连续10天给药后，取脾脏制取脾淋巴细胞，用conA和LPS刺激淋巴细胞，看有没有增强免疫力。我是把整条脾脏用注射器芯在200目筛网上研磨，用HANK'S冲洗，然后离心1000转5分钟离心，加入0.85％NH4CL破碎红细胞，作用时间5分钟左右，然后离心，hank's洗涤两次，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，调整细胞浓度为2×106个/ml,培养2小时后，取上清加入96孔板备用。
我制过几次了，每次都不理想，上清里都没有细胞，贴壁的也是怪怪的，非常的小，40倍镜下都看不太清有没有核。并且上清拿去作MTT,基本没有紫红色，也就是根本没有细胞吧？我也没见过真的脾细胞长什么样，希望大家能帮我分析一下，我该怎么解决这些问题啊？我现在很着急啊，但又摸不着门路，先谢谢大家了。
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发表于 2012-6-24 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

无菌取出脾脏置入Hanks’液中，研磨为匀浆，将筋膜组织剔干净，收集滤液，1500rpm, 10min，弃上清，加入10ml Tris-NH4Cl混悬沉淀，室温静置10min,再1500rpm, 10min，弃上清，Hanks’ 液洗涤3次，（每次均1500rpm, 5min），用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，（调成浓度为1×108/ml的细胞悬液）转入培养皿中，置37℃，5%CO2下孵育30min后（去除贴壁的细胞），收获未贴壁细胞，再将浓度调成1×106/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。这是我原来做的，应该会对你有用，附上淋巴细胞的图


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发表于 2012-6-24 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞沉底变形很正常，因为你只是裂解了红细胞，你得到的是单个核细胞，包括NK,T,B等。T细胞是不贴壁的，NK和B都可以贴壁，也就会变形。上清里没有细胞，拿去作MTT,当然没有紫红色。我们作淋转都是直接在上清中掺MTT培养4h后小心吸去上清加DMSO溶解甲臜颗粒。另外，不知道你用的破碎红细胞的0.85％NH4CL会不会对T细胞产生伤害，影响其生长。
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发表于 2012-6-24 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢两位，我今天恰恰要制取脾细胞了，真可谓及时雨啊！有关问题想请教mjc606：作淋转不是要培养48～72小时吗？为什么你们只培养4小时啊？
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发表于 2012-6-24 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按照shaverwoo教我的方法，制取淋巴细胞，这次96孔板中细胞长的还不错，但培养40小时后，加入10ul 5mg/mlMTT,培养4小时后，吸少量上清于显微镜下计数发现基本没有细胞，所以吸出100ul液体，加入100ulDMSO,振荡10分钟，结果发现实验孔的颜色仍然很浅，比对照孔要深一点，实验孔测出来的值都在0.4～0.5之间，对照孔在0.2～0.3之间，结果SI计算出来没有统计学意义，郁闷哦，为什么MTT总染不上色呢？是不是10ul太少了啊？我加的时候感觉就那么一点点。我在显微镜下还发现MTT染的细胞都是位于边缘还是在我加MTT那侧，想要请教各位，我在实验过程中还要注意什么啊？先谢谢了，真的很着急。
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发表于 2012-6-24 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试了几次，终于找到合适的浓度了，但又遇到问题了，空白对照（100ul培养液+20ulMTT+150ulDMSO）读值居然2.827，比实验孔的还大；实验孔也很奇怪，明明在显微镜下看着好多结晶，加DMSO后颜色也深，结果却比颜色浅的测的值小，希望各位大侠帮忙分析一下，是哪里的问题。
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