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标题:[求助]实验室高级教授都解决不了的癌细胞培养黑点问题

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发表于 2012-6-24 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]实验室高级教授都解决不了的癌细胞培养黑点问题



我最近养细胞，复苏了一瓶癌细胞，第二天早上一看长的还好，由于本人初次养，所以换了高倍400下一看，结果发现很多细小的黑点，但换一下显微镜的微调可以看见中间是透明的，黑点很小比起细胞来小多了，有的在蠕动，有的在原地翻动，有的在打转，我觉得像是污染当时极其郁闷和难受！找来同学都认为是污染，黑点是微生物！实验室高级教授也认为是微生物，但不知道是哪种，提到黑胶虫，我这几天天天看黑胶虫专题，但5天来感觉不像。认为如果操作没问题，应该是细胞本来就有，第二天细胞长势特好，但黑点似乎没变化并且我注意到黑点在细胞密集的地方几乎没有，而它周围细胞密度就相对少或是没有细胞。（黑点也可出现在细胞里或是在细胞间，但这两种情况少）和找到一个他们实验室的年轻老师认为不是黑胶虫污染是碎片！但下午我又发现有些黑点好像周身有毛，的确在游动。准备放弃时我无意看了5天前验菌的培养基颜色还是很清亮！前几天因为他们告诉我只要不混就行！居然发现也有一抹一样的黑点在游动，这使我怀疑我们实验室有可能都污染，是培养基有问题。 我就又看了其他人的细胞居然发现也有但没有我那末多，并且细胞长势都不错！都为肿瘤细胞！这几天我用3蒸水再高压再放进培养瓶再放进孵箱，还有一瓶就放在外面同时拧紧盖子。1天后发现2瓶居然也都有，只不过密度非常低，在高倍视野下只发现几个能动，而绝大多数黑点不动！难道这黑点是水里就有，但我是3蒸水且再高压，难道他不怕高压，我高压时间和压力均达到要求。
实验室老师也想不出啥原因,我和同学讨论过实验室的条件是应该多少有污染可能，但为啥细胞长的都还行，我问他们你们以前不看高倍吗，他们说以前一看100下都长得不错就没在意！况且黑点不如你得多！
大师，高手解决一下这个谜！我们干了20多年，博士毕业的教授都不知道该咋办！
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发表于 2012-6-24 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这几天我看了帖子，用pbs多冲了几遍，感觉黑点好像少了，但还有！
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发表于 2012-6-24 12:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人建议，仅供参考：

1　“我就又看了其他人的细胞居然发现也有但没有我那末多，并且细胞长势都不错！都为肿瘤细胞！”
胶虫有个特点：细胞状态好的时候它的影响不明显，细胞状态差的时候，它的危害往往加重。

2“　这几天我用3蒸水再高压再放进培养瓶再放进孵箱，还有一瓶就放在外面同时拧紧盖子。1天后发现2瓶居然也都有”

胶虫是可以在同一孵箱内传染的，如果是胶虫污染的话，要对孵箱消毒清理。
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发表于 2012-6-24 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先对东方朔表示由衷的感谢！
我这里讲的不明白，前天我也怀疑孵箱有问题，可我们老师就是不想说，我想是因为如果认了是他环境的问题，那咋样收我们研究生钱？于是他让我验是否是水的问题，就让我用3蒸水再高压放培养瓶，放在我自己的抽屉里，根本没进孵箱！同时拧紧盖子！居然也有一个黑点，在动！
还有我看了网上黑胶虫的照片，感觉不象，我的黑点没有那末恐怖！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-6-24 12:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该就是细菌污染 细菌有些并不是想象的繁殖那么快 也可能是霉菌 一般400倍光学显微镜可见 所谓的黑胶虫一般不用考虑 建议消化后一千转离心一分钟后 尽量弃上清 放入有双抗的培养基中 待细胞贴壁2-3小时后 换液 若细胞贴壁不牢可以使用corning的cellbind系列 或者自己在皿上包被多聚赖氨酸
另外检查别的同细胞房 操作的有没有类似的情况
若有 检查紫外 超净台滤网(包括排送风情况等) 若必要可以甲醛熏蒸灭菌
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发表于 2012-6-24 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先对楼上表示由衷的感谢！
我们用的培养基是老师自己配的，1640，是一包的，好像是giboco,40元。血清是杭州四季青210元。已加双抗！
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发表于 2012-6-24 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加点氨苄青霉素，如果对你的实验没啥影响的话。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-6-24 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我因为以前的培养 都是无抗的 所以出现了感染以后 可以很快发现 然后用双抗效果一般比较好 如果是在含双抗培养基里出现的污染 一般这种微生物都是有很强的抗性的 常规的抗生素都是无济于事的 所以只有放弃 重新复苏
取不同批次冻存的细胞复苏 因为有可能在冻存时就已出现污染 只是没有发现
另外 污染其实主要还是和环境关系很大 我不知道你们培养室的条件怎么样 如果是一般的话 还有可能污染有支原体 这种污染的典型特征就是原来长势良好的细胞 随培养的继续细胞状态不佳 若进行细胞转染等实验会发现 转染效率下降等现象 在400光镜下可见有很弱的细毛状突起
培养基的话 有条件可以采用已配制好的 液体培养基 经济条件有限的话 建议使用一次性的进口滤器 如nalgene或者millipore的
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发表于 2012-6-24 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问大家一个弱弱的问题，支原体耐热吗，因为我看见无培养基的空瓶子只放水（只有3蒸水再经高压的），居然也有一个黑点在动！
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kulee[使用道具]
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 小中大

瓶子没有洗干净 支原体不耐热 肉眼或着显微镜都看不到
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