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标题:[求助]请高手帮小弟分析一下细胞周期

pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请高手帮小弟分析一下细胞周期


小弟做的是用流式细胞仪分析细胞周期，首先通过流式分选出侧群细胞（SP）和非侧群细胞（non-sp），V是未分选的细胞（包括sp和non-sp）然后再用流式分析周期。整个过程时间较长，从早上8点到下午5点，是否会对周期检测产生影响。
请高手帮小弟分析下，跪谢。
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101010[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的细胞测周期前有没有固定？
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乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分出来的细胞马上处理！不能最先出来的和你的最后出来的细胞一起处理！

如果分选时间太长，建议分批染色，这样可以避免细胞状态改变。

这样的周期用modfit也不一定准确，毕竟是个拟合结果。感觉固定有问题。支持gzgygy的说法。检测周期的方法版内很多！

能否看看你的分选图？
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HP007[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有固定是不准确的。
所有DNA染料都有一定的RNA结合力，不固定打孔，RNA酶无法进入胞内消化RNA，所得荧光信号的CV值大幅增加，各期互侵明显，不管是自己拉水平门还是软件拟合均不能准确还原周期分布的原有面貌。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的细胞测周期前有没有固定？

————————————————————————————————————————————————————————————————

没有固定。
收集分选的一部分SP 和非SP 及未分选的SW480细胞悬液,1 000 r/ min 离心5 min , 弃上清,加solution A 250ul,用手轻击试管将细胞混匀，室温下10min；加solution B 200ul，室温下10min；加solution C 200ul，混匀，2-8℃10min，然后上机检测。
ABC是细胞室的试剂盒
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8princess8[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的试剂盒应该是不固定但是打孔，应该是detergent类打孔剂。但是请对照一下坛上标准的周期图，再看看你自己的图，就可以理解什么叫各期互侵了。你的周期分析结果无误地证实了这个问题。所以，为什么不将分选下来的细胞按最成熟可靠的方式处理来检测周期呢？我是你的话，可以利用流式分选的方法学优势，直接在接受管里装好75%的乙醇，细胞分选下来一个一个进入被分散固定，这是消化处理过程想都不敢想的最理想分散状态，必然获得最可靠合最纯净也是二次检测损伤最小（因为没有附加处理过程）的单个分散细胞悬液，然后用PI/RNA酶混合染色液一次搞掂。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢啦
不过分选下来的细胞同时含有鞘液（缓冲液）
所以还是要先离心再固定
但是SP细胞只能达到10的5次方，数量有点少
不知效果怎样
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“各期互侵明显”是什么原因造成的
是因为RNA没消化彻底吗
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发表于 2012-6-24 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢啦
不过分选下来的细胞同时含有鞘液（缓冲液）
所以还是要先离心再固定
但是SP细胞只能达到10的5次方，数量有点少
不知效果怎样

————————————————————————————————————————————————————————————————

细胞是要死的，但是脑筋是活的。
你能分十万单位数量的sp细胞，sp比例不会低的，如果只要5万个sp细胞，分出来的液体总量不会大于0.5ml，时间也不会超过30分钟。预装在接受管里的可以是95%的乙醇，体积不要超过1.5ml，最后获得总体积不超过2ml的固定细胞悬液。染色前低转速短时离心，然后小心弃去大部上清，剩下约200ul，用以打散沉淀后加入0.5mlPI/RNA酶混合染色液即可。
尽管我没有这样做过，对SP细胞的周期也暂时没有兴趣，但是凭经验和理论觉得是可以一试的，反正你现在的周期数据也不行，始终是要重新做的。万一弄出来也是有成就感的。)
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jkobn[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“各期互侵明显”是什么原因造成的
是因为RNA没消化彻底吗

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当荧光强度一致性不好，也就是CV值较大时，各期的荧光分布较为弥散，部分互相分布到本应只有对方分布的荧光强度区间，这时测出的某期含量当然就不准确了。造成各期互侵的原因主要有两个：
1. RNA没有消化好，干扰了正常的DNA荧光表现，你的试剂盒由于用detergent类“烈性”破膜剂，较难控制破膜的合适度，染色时间较短，所以有可能RNA消化不足。
2. 细胞核物质也就是DNA的量存在不均一性。
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