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标题:[求助]帮忙看下Treg流式图

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]帮忙看下Treg流式图


小鼠淋巴结淋巴细胞
横轴FITC-CD4
纵轴PE-CD25
005 总的细胞 绿色的是我设的门 以下都是门里的细胞
005 双阴性 006 cd4单阳性
007 cd25 单阳性 008 cd4+cd25 双阳性
想问 我双阴性的细胞已经调到10 一次方里面了
为什么加了抗体那群细胞就扩散到10 二次方了呢
我的条件什么的是否有些问题
希望有经验者不吝赐教


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2012-6-24 15:49
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补偿和特异荧光变现都挺好的，没有问题。
特异抗体不止会跟特异抗原结合，也会跟非特异抗原有些微结合。另一方面来说，不止阳性细胞有特异抗原高表达，阴性细胞也可能会有特异抗原的弱表达。所以特异抗体上去后，除了阳性细胞荧光明显强之外，某些阴性细胞的荧光也是有可能有较弱增强的。关键的是阳性群和阴性群群分清晰，这样就可以了。实际上空白对照设定的界限不应该是雷打不动的，移动的原则就是单荧光图阳性群和阴性群的最低交界处。
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发表于 2012-6-24 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上
不过特异荧光变现 是什么意思啊
另外还有你说的“实际上空白对照设定的界限不应该是雷打不动的，移动的原则就是单荧光图阳性群和阴性群的最低交界处。 ”是怎么回事？

我不太明白
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有以下是用小鼠脾脏淋巴细胞作的图
001空白
002 cd4单阳性
003 cd25单阳性
004 cd4+cd25双阳性
细胞总是有一部分斜斜的 怎么调都是斜的
请问这是为什么呢


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2012-6-24 15:50
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

斜的细胞群可能是细胞的碎片和死细胞，所以应该先过PI的门，去掉这些杂质。
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发表于 2012-6-24 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的实验没有那么多预算呀
不用PI的话行不行呢
还有用pi之后不就是三个颜色了么 会不会做起来更麻烦
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发表于 2012-6-24 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PI还是比较便宜的，SIGMA的也没多贵，而且可以用很久。实际上死细胞对实验的影响还是比较大的，有时出入会高达30％，所以使用PI或7－AAD去除死细胞还是有必要的。普通的流式仪只要不太老，都至少可以同时检测4色，而pi使用时选却要的都是pi阴性的细胞，不是特殊情况补偿可以不调，所以不是太麻烦。
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一叶[使用道具]
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发表于 2012-6-24 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从楼主的图上看，不太可能是死细胞，还是补偿。个人感觉空白样本出现的补偿略微不足对实际特异抗体染色后的荧光表现影响不明显，如果对百分比准确度要求很严格，加大补偿把这些对角线分布的小玩意干掉就是了。
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mamamiya[使用道具]
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 小中大
我用的抗体是FICT-CD4 PE-CD25
还想要用一个抗体是FOXP3那我应该用什么标记呢
好象我们的流式只能做三个颜色的
还有PI怎么用
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TNT[使用道具]
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 小中大

个人经验此处的斜线状细胞多为细胞碎片，标记pi此种细胞应该为pi阳性，只要选取pi阴性细胞就可以消灭他们。虽然有补偿不足，但很显然不是很严重即使加大补偿也不可能把这群倾角45度的细胞完全归到其他象限，而且个人经验这种细胞多是补偿调到极大位置也不为所动的，所以仍然建议pi染色去除。四色流式我们一般会把第三种抗体标记为APC，而pi走橙色道。pi配置成1mg/ml，上机前加1ul到样品里，混匀后直接上机检测，十分简单。
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