小中大我选的内参是PRL-TK，上次做冻融40多分钟，出来的结果达到上千万，PGL-control更是overload,可今天由于客观原因，不得已细胞裂解后冻了3个多小时，结果目的质粒检测只有几百，和阴性对照差不多，而内参和阳性对照也只有几万了，很是不解啊，预试验时这个目的质粒是上过几万的啊，自己分析原因如下，请各位指教：
1.转染效率低或失败，因为转染时细胞在6孔板内长得很满，完全超过90%，图省事，转染前没有仔细计数，教训啊？不过奇怪的是，内参居然还有几万？
2.冻融时间过长？-80度冻3-4个小时会对蛋白活性产生明显影响吗？觉得蛋白没这脆弱吧。不解。
3.LAR失活？千万别是这条，以前使用时不熟练，LAR配好后没有分装，今天实验时才分装，总共冻融过3次，平时都是-80度保存的。看说明书好像说过冻融超过3次LAR活性会大损，现在分装好了-80度避光保存着。
请各位帮我分析下，谢谢！
发完贴，发现5.1了，祝各位节假日仍奋斗在实验室，为实验夜不能寐的难兄难弟致以节日问候！！
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1.“内参居然还有几万”，以前是多少？看看目的质粒和内参的比值是否稳定。比如，以前目的质粒几万，而内参上千万；而现在目的质粒几百，而内参几万，则属正常。值都降低了，问题应该出在转染和表达上。根据你的描述，感觉很可能问题在转染，转染效率降低了。
2.冻融时间长短对luciferase活性影响不大，关键在于冻融次数，说明书上写得很明确，建议再仔细看看。我记得细胞裂解液在-80能保持活性几个月吧，反正是很长时间。
3. LAR失活：很可能。不过我没有遇到过，每次都是按说明书使用的，分装后存于-80
希望能对你有帮助，我做启动子有一段时间，也不太顺利啊。共勉！
