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标题:[分享帖]胰酶使用注意及贴壁细胞的消化

TAT[使用道具]
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[分享帖]胰酶使用注意及贴壁细胞的消化



胰酶使用注意:
1.在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。
2.胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差。
贴壁细胞的消化:
1.吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次,以去除残余的血清
2.加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟(不同的细胞消化时间有所不同)
3.显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
4.此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液,吹打下细胞,即可直接用于后续实验如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化。
如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟,沉淀细胞,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验。
供新手分享!
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TAT[使用道具]
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有个战友问消化细胞可以用胶原酶吗?我再贴点给大家分享!
一、酶消化法。

1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞,在37度条件下,一般消化1-5分钟就足够了(根据姨酶效率不同具体把握)。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液,否则影响活性。保存于-20度。

2、胶原酶。这种方法比较少,一般是用原代培养时,从组织消化下细胞。这种方法作用温和,对细胞损伤较小,但是,价格也较贵。中止同样是用血清。

二、离子螯合剂:不破坏细胞表面分子,仅与CAMs螯合,因此,如果检测细胞表面分子的话,最好要用无酶消化法。

1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质,对细胞间也有一定作用。注意,它能显著影响pH值,而且在弱碱性条件下才易溶。因此,配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此,消化下来的细胞要拿PBS洗一遍。

2、商品化的无酶消化液。细胞无酶消化液不含蛋白消化酶,但能可使贴壁细胞与培养瓶皿表面脱离而达到分离细胞目的,特点是1.避免蛋白酶过度消化细胞及降解样品中的目的蛋白,2.收集细胞用于Western Blot,避免目的蛋白降解,3.分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

三、物理法用细胞刮子将细胞刮下来或直接吹打。
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zhezhe[使用道具]
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谢谢分享。请问商品化的无酶消化液是什么成分呢?,我正要做Western Blot
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66小飞侠[使用道具]
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按楼主说的无酶消化液归离子螯和剂,那具体原理是什么啊?请教
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xingyi08[使用道具]
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谢谢,分享!

不过,我养HEP-2细胞时,用的0.25的胰酶,2分钟根本就消不下来。现在都快5分钟了,不过,对细胞影响好像不太大
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mimili_901[使用道具]
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楼主说胶原酶用血清终止,这个有点不对吧。
不知道楼主用的是什么血清可以终止胶原酶的消化?
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TAT[使用道具]
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常用的细胞消化液为胰蛋白酶(Trypsin),EDTA等,其功能主要是使细胞间的蛋白质(如细胞外基质)水解,改变细胞间的连接,使组织或细胞片分散成单个细胞,制成细胞悬液用于进一步的实验。

影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等 。
• 加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多(依培养器皿的大小而定),以使充分浸润;
• 一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明、点状(出现细小空隙)时,弃去细胞消化液,或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化,吹打分散;如见大量细胞片状脱落,已消化过头,则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。(消化过头,可造成大量细胞从瓶壁上脱下,甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂,所以加入完全培养基可以终止反应。

关于楼上得问题,胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase),它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,而不损伤其它蛋白质和组织,当然也可以是细胞外基质中得胶原蛋白了。终止反应同样是由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂。

如果有不对得,请大家指正!
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yueban-1147[使用道具]
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我养的是舌癌SAS细胞,用0.25的胰酶2ml,孵箱内放上6-8分钟,细胞始终不变形,吹打下来了,但是细胞全都没有贴壁,死了。怎么办呢?请大家帮我出出主意。谢谢了
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any333[使用道具]
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细胞衰老半乳糖甘酶的配制?谁能教教我
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xingyi08[使用道具]
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你的舌癌细胞如果不适合化学法消化的话,可以试试物理消化!
想向楼主请教,胶原酶一般用来消化组织,那他具体做用于细胞的什么部位?是细胞外基质中什么某中物质吗?
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