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标题:[求助]G418筛选8天了，细胞死亡的很少啊！

XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]G418筛选8天了，细胞死亡的很少啊！



pCDNA3。1重组质粒转染L929细胞，转染前做了预筛选实验，确定G418筛选浓度为1000ug/ml，转染24h后重新1：6铺板，24h后加G418筛选，但是到今天是第8天了，死细胞非常少，6孔板都快长满了，消化了一个孔，再1：10铺板筛选，还是死细胞很少啊，不知什么原因啊！请XDJM来帮助！！非常感谢！
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yes4[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你做对照了吗?筛选的时候应该用2个孔是未转染的细胞,同样加相同浓度的G418,对照孔细胞全死了以后才可以将转染的细胞挑取克隆;
另外筛选的时候刚开始几天细胞死的是比较慢,后面死的就很快，要不你再过两天看看.
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发表于 2012-6-24 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼上的，我曾经在第９天的时候还能看到大量的活细胞，但是再过２４小时，几乎实在一夜之间对照组的细胞全部死亡！
你既然做过预筛选实验就应该没有什么大问题，再观察几天！
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的，我再耐心等待，pCDNA3.1筛选有点累人啊!
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418筛细胞好像是这样的，其实细胞已经死了，但并不飘起来，而是贴在细胞上，感觉像是没有杀死，但时间长了，就会飘起来的。
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发表于 2012-6-24 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

到今天已经是筛选第12天了，正常未转染的细胞第8天已经全部死光光了，但是这个转了基因的就是死不多啊！到底该怎么办啊？
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你再等2天看看。我们一般筛选2周效果不错。如果还不死的话，选几孔消化下来重新铺板培养，抗性筛选。或者选一孔消化下来检测一下细胞死活情况。再就是G418的预实验浓度上想想，是否浓度不够。也许象coven说得，其实细胞死了，只是暂时没有 飘上来。
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-6-24 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位，厉害您说“如果还不死的话，选几孔消化下来重新铺板培养，抗性筛选。或者选一孔消化下来检测一下细胞死活情况。”重新消化铺板筛选时，要提高药物浓度吗？您出现过这种情况，并且有筛选出阳性克隆吗？ 多谢各位了！
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发表于 2012-6-24 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重新消化铺板的目的是看看到底还是多少细胞能贴壁，是否还都会贴壁。如果G418浓度没错的话，我想不必提高药物浓度了吧？毕竟你的未转染细胞全死了。我没有出现过你的情况，给你出的注意。只是提供可能的问题，供你参考。再说，生物实验就是这样。即使相同的条件，不同人手法不同，结果不同。你再试试看吧，相信你会成功的。
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XYZQ[使用道具]
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 小中大
谢谢，试验前人的经验很重要，尝试也很重要！谢谢各位的帮助和鼓励！所以喜欢来这里！
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