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标题:[求助]人晶状体上皮细胞生长缓慢且死漂？

sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]人晶状体上皮细胞生长缓慢且死漂？


我最近在养人晶状体上皮细胞,买的是永生系B3,用的是DMEM(高糖)+20%胎牛血清,细胞生长较慢,而且有大量死细胞漂浮,培养基一天就会变黄,不知道是什么原因?
求高手帮忙!
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glass[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

代次少且刚复苏的B3细胞是长得很慢的，但有大量死漂肯定有问题，请把照片发上来看看
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

B-3是永生化细胞，很好养，一般4～5天就可传代。传代关键技术是消化时间控制：
消化时间1～2秒，如果培养基不是很新鲜，消化时间最多不超过30秒。再马上用D-Hank’s洗一遍，吸干（一定要把胰酶吸干！！！），然后用培养液吹打，分瓶。

培养基变黄可能是有污染！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我消化细胞用的是０．２５％胰蛋白酶，未加ＥＤＴＡ，消化时间为４～５分钟，这样是否合适？同时发现较多细胞长到第四天时只出现细胞核分裂（即出现双核或多核细胞），求助原因？另外请问高糖是否对细胞有影响，谢谢
　　
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hold住[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我消化细胞用的是０．２５％胰蛋白酶，未加ＥＤＴＡ，消化时间为４～５分钟，这样是否合适？同时发现较多细胞长到第四天时只出现细胞核分裂（即出现双核或多核细胞），求助原因？另外请问高糖是否对细胞有影响，谢谢

——————————————————————————————————————————————————————————————　　

B-3消化应该加EDTA，根据经验，你的B-3消化时间太长了。实际根据胰酶新鲜程度控制在几秒内，最多不超过30秒，俗称“过一下”即可！用高糖培养基没问题。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思,我还没照照片.也不是有很多死细胞漂浮.谢谢你的回复.我还有些问题想咨询你.请问一般细胞多长时间换一次液,是否经常换液不利于细胞生长?因为是初次养人晶状体上皮细胞,而且细胞寄来时已经完全拖壁,细胞状态也不好,同时发现细胞养一段时间后形态好象也变化了,不知道是否属于正常情况?

————————————————————————————————————————————————————————————————

那就是生命力顽强的传代存活下来了，怪不得，换液频率要根据细胞密度及培养液的变化来定，我一般3-4天左右换一次，准备传代的话也就不换液了，一天就变黄了肯定有问题。 刚复苏的细胞长得挺慢的，我记得收到细胞后传代 7天左右才满传代呢，细胞形态的确会变（各种因素导致），可能就意味着实验不好做，做不出理想的结果，所以要经常冻存复苏，尽量保证代数一致，通过冻存复苏也可以淘汰一批质量不好的细胞（个人认为）。
消化的话，如haha63所说，目前这种天气 0.125％酶＋0.01％EDTA就够了，几十秒到1min就可以消化下来（收缩变圆即可），单用酶也是可以的，只是不便吹散，但从实际情况来看关系也不大。"出现双核和多核" 是不是细胞内颗粒增多，感觉很“脏”，建议有条件的话，流式测DNA，看看有没有肿瘤细胞那样的多倍体出现（听上一届说的，记不太清楚了）。个人观点，仅供参考。GOODLUCK
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
“请问你当时传代是按1:几传代的,你用的培养基里面包括哪些成分,我用的是DMEM(高糖)+20%胎牛血清,另外还加了二抗和2.0克/升的NaHCO3,以及谷氨酰氨.同时做的两瓶细胞居然发现有一瓶污染了,细胞全部不贴壁且有大量黑色丝状物快速移动,估计是大肠杆菌感染,但不知道原因出在哪?会不会是操作的问题,”

1. 1：2--5 都有过，看细胞的长势了
2. 我不加二抗的，无所谓了
3. NAHCO3 我用 3g/L（5%CO2），没有太多什么道理的，个人感觉不错。2.0也不是不可以
4. 一般培养液都比较新鲜，用得很快，所以我从不加谷氨酰氨
5. 操作中出现污染的概率很大，另外一瓶没事的话，实属万幸，好好想想哪个环节出了问题，但你很可能找不出原因，下次小心操作。
祝好运！

因为个人知识有限，回答肯定有不周之处，所以帖出您的PM，大家一块来分析
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-26 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢版主的耐心解答.
另外请问用消化液(0.25％酶＋0.02％EDTA)消化前后用D-hanks洗涤,消化后的洗涤液如何处理?是洗涤后直接倒掉还是用吸管吸除还是离心后倒掉?我昨天就直接倒掉了,发现细胞几乎给倒没了.我想可能是消化时间有点长或者洗涤液直接倒掉不妥.但是如果每次都离心的话,似乎也很麻烦而且离心本身对细胞也不好.求助高手解答,先谢了.
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发表于 2012-6-26 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我只是想传代后继续培养,然后多几瓶以后再冻存,不是要冻存,所以就没必要离心.再者D-hanks也不能终止胰蛋白酶的消化作用,如果离心的话会不会出问题.谢谢

消化液/含血清的培养液（消化终止）/D-hanks一块离心后再洗一次再传代
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101010[使用道具]
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 小中大

曾用过楼上的方法，但总会倒掉一些细胞，天冷时也没有那么好消化（跟外界温度有关，尽管酶预暖，酶在37度左右效果最佳，该细胞对酶很敏感）
我们的消化方法（常规的）：
(1)、细胞基本融合后，弃去培养液，加入预暖的消化液；
(2)、1min左右，见细胞收缩、变圆时立即加入含血清的DMEM终止消化，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞从培养瓶底脱落，制成单细胞悬液；
(3)、将细胞悬液水平离心（1000 rpm/min，4-5 min），弃上清液，PBS洗一次；
（4）分瓶 1：2--5
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